EMSA试剂盒使用方法介绍

  EMSA试剂盒使用方法介绍基因结构和功能系列CAT#:131039-100低温运输，-20℃保存即用型EMSA试剂盒ElectrophoreticMobilityShiftAssayKit使用手册V1.0产品及特点凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay），也称gelshift，是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通过EMSA可以研究目的蛋白和特定的DNA序列的结合情况，从而能够研究细胞内一些转录因子的激活水平。其原理如下：本产品具有下列特点：1.一站式，使用起来更便捷，本试剂盒提供了进行EMSA实验的探针标记、蛋白和DNA结合以及EMSA上样液等主要试剂，使EMSA实验变得简单方便。2.非特异性结合低，EMSA结合缓冲液中含有poly(dI-dC)等有效成分，其中poly(dI-dC)的浓度经过优化，能很好的消除蛋白和标记探针间的非特异性结合，同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合。3.用户需自备待标记的EMSA探针、用于探针标记的同位素、EMSA胶配制的相关试剂。4.本试剂盒足够标记10-20次探针，足够进行100个蛋白和探针的结合反应。规格及成分成份编号100次包装T4PolynucleotideKinase131039A100UT4PolynucleotideKinaseBuffer(10×)131039B100μLNuclease-FreeWater131039C1mL探针标记终止液131039D100μL5M醋酸铵131039E600μLEMSA结合缓冲液(5×)131039F200μLEMSA上样液(蓝色，10×)131039G200μLEMSA上样液(无色，10×)131039H200μLTE溶液131039I2mL使用手册1份运输及保存低温运输，-20℃保存，有效期一年。自备试剂待标记的EMSA探针、用于探针标记的同位素、EMSA胶配制的相关试剂等使用方法一、探针的标记：1.探针标记的反应体系如下：成份用量待标记探针(1.75pmol/μL)2μLT4PolynucleotideKinaseBuffer(10×)1μLNuclease-FreeWater5μL[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmolat10mCi/mL)1μLT4PolynucleotideKinase(5-10u/μL)1μL总体积10μL按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4PolynucleotideKinase，混匀。2.37℃反应10分钟。3.加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。4.再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。5.标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。二、探针的纯化：通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有一些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可根据如下步骤操作：1.对于100微升标记好的探针，加入1/4体积（即25微升)的5M醋酸铵，再加入2倍体积（即200微升）的无水乙醇，混匀。2.在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。3.在4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。4.在4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。5.加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。三、EMSA胶的配制1.准备好倒胶的模具。能够正常的使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最优选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以再一次进行选择可灌制较大EMSA胶的模具。2.按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。成份用量TBEbuffer(10×)1mL重蒸水16.2mL39:1acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v)2mL80%甘油625μL10%过硫酸铵(ammoniumpersulfate)150μLTEMED10μL3.按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。假如发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。四、EMSA结合反应：1.按照下表加入EMSA结合反应各成分：成份阴性对照样品探针冷竞争反应突变探针的冷竞争反应Super-shift反应Nuclease-FreeWater7μL5μL4μL4μL4μLEMSA结合缓冲液(5×)2μL2μL2μL2μL2μL细胞白或纯化的转录因子02μL2μL2μL2μL未标记的探针----1μL----未标记的突变探针------1μL--目的蛋白特异抗体--------1μL标记好的探针1μL1μL1μL1μL1μL总体积10μL10μL10μL10μL10μL2.按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温 （20-25℃）放置10分钟，从而消除有几率发生的探针和蛋白的非特异性结合，或让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。3.加入1微升EMSA上样缓冲液(无色，10×)，混匀后立即上样。注意：有一些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。五、电泳分析1.用0.5×TBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，能加入少量稀释好的1×的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是不是正常进行。2.把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1×的EMSA上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。3.按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度上升，需要适当降低电压。电泳至EMSA上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。4.剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。5.在干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设施检测。六、结果分析上图为典型的EMSA分析图，各上样孔介绍如下：1.为阴性对照反应(标记探针)；2.为常规反应(含激活的目的转录因子的白＋标记探针)；3.为探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的白＋标记探针标记探针100倍量的标记探针)；4.为突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的白＋标记探针标记探针100倍量的未标记突变探针)；5.为Super-shift反应(含激活的目的转录因子的白＋标记探针目的转录因子的特异抗体)。

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