发布日期： 2024-04-21 16:34:09 来源：GC法检测
扬州大学 Nat. Microbiol.：高脂饮食喂养小鼠肠道菌群的改变与抗生素耐受性相关
抗生素耐受性是一种典型的易感微生物在长期暴露于抗生素下生存的能力，在慢性和复发性细菌感染中起着关键作用，并促进抗生素耐药性的演变。
抗生素耐受性是一种典型的易感微生物在长期暴露于抗生素下生存的能力，在慢性和复发性细菌感染中起着关键作用，并促进抗生素耐药性的演变。然而，促进抗生素耐受性发展的在体内生理因素，尚不完全清楚。尽管高脂饮食（HFD）与多种人类疾病有关，但HFD与抗生素处理之间的关系仍知之甚少。在本研究中，作者评估了多种临床相关抗生素对感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）或大肠杆菌的HFD喂养小鼠的影响。作者发现，与标准饮食喂养的小鼠相比，HFD喂养的小鼠具有更高的细菌量，这些细菌对抗生素处理的敏感性较低，而无菌标准饮食或HFD喂养的小鼠表现出类似的敏感性。HFD喂养小鼠的粪便微生物群移植损害了标准饮食喂养小鼠的抗生素活性，表明HFD喂养小鼠肠道微生物群和相关代谢物的改变可能是抗生素活性降低的原因。粪便样本的16S rRNA测序和代谢组学分析显示HFD喂养小鼠的微生物多样性和差异代谢谱降低。有必要注意一下的是，色氨酸代谢物吲哚-3-乙酸（IAA）在HFD喂养的小鼠中明显降低。进一步的体外研究表明，添加IAA可抑制细菌持久性物质的形成，并通过激活细菌代谢途径促进持久性物质的清除。在体内，IAA和环丙沙星联合使用可提高感染MRSA持久性的HFD小鼠的存活率。总的来说，本研究的多个方面数据显示HFD对小鼠模型中的抗生素处理有拮抗作用，这与肠道微生物群和IAA产生的改变有关。在本研究中，作者研究了抗生素对标准饮食和HFD喂养小鼠多种病原体的杀灭作用。有趣的是，发现HFD降低了小鼠感染模型的抗生素处理，这进一步证明与肠道微生物群和相关代谢物组成的变化有关。此外，本研究的多个方面数据显示，小鼠HFD影响IAA的生物合成，IAA可能通过激活细菌代谢而抑制和消灭耐受细胞。总之，本研究根据结果得出，长期HFD通过改变肠道微生物群的组成和多样性而损害抗生素的疗效。
HFD降低小鼠模型中抗生素的效力。a、喂食标准饮食或HFD后小鼠体重的动态变化。每组n = 10只独立的动物。b、用标准饮食或HFD喂养64天以后小鼠体重的增加量。每组n = 10只独立的动物。c、油红O染色(×200）的肝脏。比例尺：100 μm。器官中的脂质被染成红色。实验独立重复了三次，其结果一致。d、评估环丙沙星（CIP）对喂食标准饮食或HFD并感染四种细菌的小鼠处理的实验方案。e、HFD对环丙沙星体内对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的杀灭作用。每组n = 6只独立的动物。CD-1雌性小鼠用标准饮食或HFD喂养64天，用非致死剂量的四种细菌（10
个菌落形成单位（cfu）/只小鼠）进行腹腔感染，并用单次灌胃剂量的环丙沙星（1 mg kg
B2）或PBS作为对照组。那么，感染24 h后，处死小鼠，计算环丙沙星处理前后肺c.f.u.的减少。黑色虚线表示c.f.u.没有减少。f、评估四种抗生素对喂食标准饮食或HFD并感染MRSA T144的小鼠的处理的实验方案。g、HFD对不一样的种类抗生素对MRSA T144在体抗菌活性的影响。n = 每组6只独立的动物。CD-1雌性小鼠用标准饮食或HFD喂养64天用非致死剂量的MRSA T144（每只小鼠10
cfu）腹腔感染，并用单次灌胃剂量的4种抗生素（80%）处理 mg kg
万古霉素）或PBS作为对照组。感染24 h后，对小鼠实施安乐死，并计算在没有和存在抗生素处理的情况下肺部
转化了cfu在24小时时减少小鼠肺部的细菌量， y轴上显示了在进行和没进行抗生素处理的情况下感染。显示的数据是平均值 ± 标准差.（a和b）或中位数（e和g）。采用Student’s
-tests检验（a和b）或Sidak多重比较检验（e和g）的双向方差分析（ANOVA）确定
对抗生素的体内处理的潜在影响，这样做才能够避免细菌定植差异的影响。我们第一步在标准饮食和
）。为了进一步确定此现状是否都会存在于具有不一样作用模式的别的类别的抗生素中，我们应用了四种临床相关抗生素，包括氨苄西林、卡那霉素、多西环素和万古霉素，来处理标准饮食或
）。与其他三种抗生素相比，多西环素是一种抑菌抗生素，它能特异性结合核糖体的
喂养的小鼠可能有较差的抗生素吸收动力学或抗生素渗透作用。为了验证这一假设，我们在给老鼠单次灌胃环丙沙星（
）后进行了药代动力学实验。在不同时间点测定血浆和器官（肺、肝和肾）中的药物浓度。然而，在标准饮食和
图2.抗生素处理受损与药物药代动力学无关，但与肠道微生物群相关。a、环丙沙星在标准饮食和HFD喂养小鼠体内的药代动力学特征。64天后的CD-1雌性小鼠标准饮食喂养组和HFD组给予单次灌胃剂量环丙沙星（20 mg kg
），24 h内收集血浆、肺、肝和肾样本（每个时间点有4只或6只生物学上独立的动物）。使用LC–MS/MS分析样品中的环丙沙星含量，并使用曲线下面积与标准品浓度的线性回归建立的标准曲线计算了对应的浓度。数据是平均值 ± 标准差。b，标准饮食和HFD喂养小鼠的微生物群消耗方案；每组 6只独立的动物；ABX：抗生素混合物。c、初始喂养的微生物群减少（i）而不是感染前5d（ii）抵消了标准饮食或HFD对环丙沙星活性的影响。每组n = 6只独立的动物。横条代表中间带。
值采用Sidak多重比较检验的双因素方差分析。d、喂食HFD小鼠粪便微生物移植的实验方案。每组n =12只独立动物。行的长度不反映维持的时间。Trans：移植。e、用HFD喂养的小鼠进行微生物移植后，标准饮食喂养的小鼠肺部MRSA T144的细菌减少率较低。CD-1雌性小鼠（每组n =12只独立的动物）用非致死剂量的MRSA T144（每只小鼠10
）在感染后2 h检测。横条代表中间带。采用非配对双尾Student’s
值。f、在感染致死剂量MRSA T144（7.5%）的小鼠腹膜炎模型中，微生物群移植小鼠的存活率较低 × 每只小鼠108立方英尺），然后用单次灌胃剂量的环丙沙星（100 mg kg
）在感染后2h检测。每组12只独立动物。采用双侧对数秩（Mantel-Cox）检验计算了
型糖尿病。此外，最近的一项研究表明，低纤维饮食加重了微生物群的崩溃，延缓了抗生素处理后的恢复。依据这一些例子，我们认为
可能改变小鼠的肠道菌群。为了检验肠道微生物群是否在这一过程中起着关键作用，我们尝试从一开始就通过饮用含抗生素混合物的水来消耗两组小鼠的肠道微生物群。同样，在这些无菌小鼠中，
）。有趣的是，我们得知，与野生型小鼠相比，无菌小鼠体重增加更高，标准饮食组和
）。这一发现意味着长期接触抗生素与体重增加之间有潜在的相关性，这在之前的几项研究中得到了部分证明。同时，我们观察到，在微生物群缺失的小鼠中，
的定植能力略低于野生型小鼠，这可能是由于缺乏来自肠道微生物群的关键营养素所致，值得在今后的研究中进一步研究。然而，在这些无菌小鼠中，标准饮食组和
诱导的小鼠肠道微生物群落的改变可能介导了抗生素处理的丧失。然而，在感染前
小鼠会导致肠道微生物群的改变，并随后改变某些特定代谢物的水平，因此降低了抗生素对小鼠模型中细菌感染的处理。
）。拟杆菌门是一个表型多样的革兰氏阴性和专性厌氧菌群，构成胃肠道正常菌群的主要部分。
对饮食诱导的肥胖有保护作用。嗜粘液性与促进伤口愈合、诱导抗肿瘤反应和肠道适应性免疫反应有关。接下来，我们用
指数比较了两组之间的肠道微生物多样性。有趣的是，与标准饮食喂养小鼠的肠道微生物多样性相比，
图3.微生物多样性和代谢组学分析显示HFD喂养小鼠肠道微生物群和代谢物的改变。a、标准饮食或HFD喂养小鼠粪便样本中OTU的相对丰度。每组3只独立的动物。这些颜色代表微生物群落。b、c、Shannon（b）和Chao多样性（c）标准饮食或HFD喂养小鼠粪便样本的丰度高度指数。每组3只独立的动物。数据是平均值 ± 标准差、采用非配对双尾t检验计算了
值。d、标准饮食（S）或HFD喂养（H）小鼠粪便样本中前30位代谢物的热图分析。每组n = 6只独立的动物。热图中的每一列代表一个样品，每一行代表一种代谢物。颜色表示样品组中代谢物的相对丰度，颜色梯度和值之间的对应关系显示在梯度色块中。左侧显示代谢物聚类树。分支之间的距离显示代谢物表达模式的接近性。右侧显示了预测值（VIP）中代谢物变量的重要性，该值表示代谢物对两组间差异的贡献。默认值设置为不小于1。值越大表示两组之间的代谢物组成差异越大。条带颜色表示两组间代谢物的统计显著性（
值越小，颜色越深。采用双侧Fisher精确检验和Benjamini-Hochberg修正法计算
0.001。IAA被标为红色。e、基于显著改变的代谢物的KEGG途径富集分析。左侧显示每个KEGG路径的名称，右侧显示相应的
值采用双侧Fisher精确检验和Benjamini–Hochberg校正进行多次检验。f、人类代谢组数据库具有不一样代谢物的化合物分类。饼图中的每种颜色代表不同的人类代谢组数据库分类，其面积代表分类中代谢物的相对比例。这一类中显著改变的代谢物的总数量在括号中显示，相应的比例在括号中显示。
影响了特定肠道微生物群的丰度，接下来我们试图研究微生物变化引起的细菌衍生代谢物的改变。为此，我们对标准饮食和
途径分析表明，这些差异代谢物大多分布在在与有机酸相关的代谢，包括胆汁酸生物合成，
）。因此，我们进一步分析了有机杂环酸与显著不同的水平之间的两组。有趣的是，我们得知喂食
可能在抗生素的杀灭中有一个以前未被重视的作用之后，我们接下来开始阐明其潜在的作用模式。首先，我们用棋盘格法测试了
可能触发抗生素耐受的形成，描述这些表型耐受细菌的一种生物学现象，但没有增加
T144持久性菌株的形成的分析（a）和环丙沙星在清除MRSA T144持久性菌株中的活性（b）在IAA浓度从0增加到100 mM的情况下。数值为：平均值 ± 标准差，来自两到三个生物重复。
值采用非参数单因素方差分析进行计算。20天时MRSA T144持续存在的平均百分比如a所示。MRSA T144在MHB和MHB+IAA培养过程中DEGs如a. c–f所示、火山图（c和e）和KEGG路径（d和f）。在c和d中，起始给IAA。在e和f组，在12小时的时间点补充IAA h。通过基因表达水平分析确定DEGs的
-transformed FC≤ −1），并用c和e中的两条垂直黑线和一条水平黑线加以区分。显著上调和下调的基因分别以红色和蓝色显示。转录无明显变化（nosig）的基因以灰色显示。相关路径中的DEG数量显示在d和f中。g、h、细胞内ATP水平（g）和ROS生成（h）在存、不存在IAA（50 mM）的情况下MRSA T144中的变化。在ATP水平分析中，MRSA T144持续细胞与不同浓度的环丙沙星和/或IAA（50 mM）。1 h时间点，收集细菌沉淀物并用溶菌酶溶解，然后制备上清液，用萤火虫荧光素酶测定细胞内ATP水平。单用环丙沙星或联合IAA处理MRSA T144耐药细胞后总ROS的产生（50 使用荧光探针（2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA），10 µM）。孵育1 h后，立即测定荧光强度，激发波长为488 和525 nm 。数据是平均值 ±标准差、三个生物学重复。
值采用非配对双尾t检验。i、标准饲料喂养小鼠的存活率（每组n = 10只独立的动物）感染致死剂量的MRSA T144持久性悬浮液（每只小鼠1.5 × 10
）在2点感染后1h。在7天内监测小鼠存活率。采用双侧对数秩（Mantel-Cox）检验计算了
值。j、HFD喂养小鼠的存活率（每组n = 10只独立的动物）感染致死剂量的MRSA T144持久性悬浮液（每只小鼠1.5 × 10
）在感染后1h 取了2个点。在7 d内监测小鼠存活率。采用双侧对数秩（Mantel-Cox）检验计算了
）基因，编码两个重要的毒力因子，金黄色葡萄球菌的杀白细胞素和溶细胞素分别显著下调。这一根据结果得出，补充
早期的研究报道，细菌代谢的减少与抗生素耐受性的形成有关。因此，我们推断
的过度生成，而这已被证明对抗生素的活性至关重要。相反，抑菌抗生素的活性与细菌的代谢状态和
人们越来越认识到，抗生素耐受性在细菌感染的高负担和许多临床抗生素处理失败中起着至关重要的作用。例如，不生长或生长缓慢的细菌抗生素处理后得以存活。一些细菌的生理反应也表明，赋予抗生素耐受性的细菌。例如，通过减少促氧化代谢物的产生和提高抗氧化防御能力，主动饥饿信号严格反应导致生物膜和营养有限细菌的抗生素耐受。此外，硫化氢（
）减轻了抗生素引起的氧化应激，从而提供了对抗抗生素杀死细菌的普遍防御。尽管如此，哺乳动物的社会行为如高脂肪饮食生活方式与抗生素耐受性的形成之间的关系仍然是未知的。
是一种天然存在的植物激素，因其在植物生长发育中的作用而闻名。它通常在动物粪便中检测到，并由人类共生细菌（如类杆菌）和人类病原体（如艰难梭菌、鼠伤寒沙门氏菌和结核分枝杆菌）产生。此外，
也是一种调节光反应的植物激素。由于这一特点，它最近被作为光动力疗法痤疮光敏剂，具有减少皮脂，抗炎和抗菌作用。此外，
的安全性，一些研究已经调查了其在小鼠和大鼠体内的致畸潜力；然而，他们发现
对肠道微生物群的影响。例如，研究表明，同时给予褪黑素可减轻脂质积聚，并逆转
可激活细菌代谢，使耐受性病原体对抗生素杀灭再敏感。我们的研究结果不仅揭示了
在处理细菌感染中的潜在危害和风险，而且提示细菌代谢调节因子可当作潜在的抗生素佐剂来处理由耐受性病原体引起的顽固性感染。