中疾控专家详解：新病毒是如何发现的？检测试剂盒使用如何？

  “2019年12月31日凌晨，我们接到通知，武汉出现不明原因肺炎聚集病例，于是紧急部署，第一时间落实武汉不明原因疫情处置工作。”中国疾控中心病毒病预防控制所党委书记武桂珍说。

  该所职工昼夜奋战，在接到标本3个小时后获得了实时荧光定量RT-PCR检测阳性的检测结果；用时24小时获得病毒全长基因组序列；1月4日成功研制出灵敏度明显高于其前期釆用试剂的高特异性PCR检测试剂。

  为确保实验室生物安全，1月4日制定出《实验室生物安全指南》，1月7日制定完成《实验室检测技术指南》；1月7日晚从临床样本中病毒分离成功；1月12日，从环境样本中成功分离病毒；1月24日，全球首发了第一株新冠病毒（2019-nCov）毒株信息。

  武桂珍介绍，2020年1月2日中午12点，病毒病预防控制所第一次接收到湖北省疾病预防控制中心送检的4例武汉不明原因病毒性肺炎疫情病例标本。“我们先用通用型冠状病毒的引物探针进行实时荧光定量RT-PCR检测临床标本中冠状病毒的核酸，结果为阳性，提示该临床标本中存在一种冠状病毒。”

  为进一步确定病原，该所使用高通量测序技术，历时24小时完成首批标本的序列测定，从临床标本中获得了病毒的全长基因组序列。

  基因组比对结果为，该病毒与已知的冠状病毒差别较大，与浙江舟山的蝙蝠冠状病毒bat-SL-CoVZC45的核苷酸序列最为相近，序列相似性仅为85%，与SARS冠状病毒的相似性为82%，判断其为一种新冠病毒。

  “1月7日，我们在电镜下观察到典型的冠状病毒的颗粒形态，证实病毒分离培养成功，也为确定新型冠状病毒感染是引起武汉聚集性病毒性肺炎的病因提供了最重要的实验证据。”武桂珍说。

  武桂珍表示，所有这些重量级的工作，我们仅用了5天时间就完成了，这是大家协作、拼搏、奋斗的结果。

  “为做好新冠病毒的检测，根据新冠病毒基因序列特征和我们以往对冠状病毒科病毒如SARS、MERS核酸诊断试剂的研发经验，很快设计完成了灵敏度和特异度均较高的引物和探针，用于2019-nCoV的快速检测。“武桂珍说。

  截至2020年1月25日，使用该检测试剂，对湖北武汉117名病例共约700份标本进行仔细的检测；对除湖北、内蒙古和西藏之外的28个省（区、市）的首例病例标本共53份做复核；湖北省疾控中心使用该试剂，对1000余份标本进行了检测。

  1月6日，中疾控病毒病所武桂珍研究员和谭文杰研究员携带本试剂赴湖北省疾病控中心，与此前某机构研发的试剂进行平行检测发现，病毒病所设计的检测试剂灵敏度明显高于其前期釆用的另一种试剂，同时具有较好的特异性。

  “1月10日，在第三方监督下，我所研发的试剂与另两家单位研发的试剂，在湖北省疾病预防控制中心进行的综合考核评估中，我所研发的诊断试剂阳性符合率100%、特异性100%，灵敏度最优。”许文波自豪地说。

  国家卫健委根据考核结果，将病毒病所研制的新冠病毒核酸检验测试试剂指定作为全国疾控系统使用，用于新冠病毒肺炎的实验室诊断。

  这里的检测试剂指的是2019-nCoV核酸检测，是一种极为敏感的放大系统，该办法能够直接揭示病原体的存在，能客观反映病原体在人体内感染过程中在呼吸道等系统中排毒时间及其病毒载量，可当作临床治疗效果和接触隔离的一个有效监控手段。

  此次应用针对新冠状病毒研发的核酸检验测试试剂可为新冠病毒肺炎的确诊提供准确的实验室依据，对及时甄别可疑病例，防止疫情扩散起到了关键性作用。

  许文波介绍，传染病的诊断需要结合三方面的资料——流行病学史、临床表现和实验室检测。

  “此次新冠病毒肺炎的流行病学史，如病例与传染源的接触史、传播链等尚不清楚，而临床表现方面，如发热、咳嗽等症状又与其他呼吸道传染病难以区分，同时也存在不典型临床表现。”许文波说，因此。特异性的实验室检测就显得很关键。

  针对疑似患者的咽拭子、肺泡灌洗液等标本，采用病毒病所研发的试剂可在3-4小时内完成实验室确诊，这对于后续病例隔离、治疗以及整个疫情防控提供了关键依据。

  1月19日，该所向全国31个省、市、自治区和新疆生产建设兵团疾控中心发放核酸检验测试试剂累计19250人份，试剂发放做到了“全覆盖、无死角”。

  作为疫情最为严重的湖北省，病毒病所累计为湖北发放了11900人份检测试剂（截至1月23日）。湖北省疾控中心根据中疾控病毒病所公布的引物探针序列自行组装了8000人份的检测试剂。

  此外，全国各省疾控中心也自行采购了相当数量的检测试剂。据不完全统计，截至1月23日16:00，全国31个省、市、自治区和新疆生产建设兵团疾控中心累计使用检测试剂3万余人份。

  1月21日，受国家卫健委国际司委托，病毒病所向香港卫生署和澳门卫生局分别赠送了540人份和140人份新冠病毒检测试剂，用于当地的疫情防控。1月22日，采用病毒病所提供的检测试剂，澳门地区确诊了首例新冠病毒感染病例。

  疫情伊始，新冠病毒的来源还不清楚，因此，亟需进行新冠病毒的溯源，从而遏制病毒传播。我所在新冠病毒溯源研究中取得阶段性进展，首次从华南海鲜市场的585份环境样本中，检测到33份样品含有新冠病毒核酸，并成功在阳性环境标本中分离病毒，提示该病毒来源于华南海鲜市场销售的野生动物。追溯病毒来源、控制源头、阐明病毒中间宿主，是控制该病毒持续从动物传染到人的关键环节。

  武汉新冠病毒疫情早期确诊的病例，大多来自武汉华南海鲜市场。2019年12月31日，根据中国疾控中心要求，病毒病所选派专家组赴武汉参加疫情防控，于2020年1月1日凌晨，起草《环境溯源工作方案》。

  1月1日上午8时赴华南海鲜城，针对病例相关商户及相关街区集中采集环境样本515份，运送至病毒病所进行仔细的检测。1月12日，病毒病所专家再次在华南海鲜市场采集野生动物贩卖商铺相关标本70份，并转运至实验室做检测。

  两批华南海鲜城的样本共计585份，PCR检测结果为其中33份标本为新冠病毒核酸阳性。这些阳性样本分布在市场上的22个摊位和1个垃圾车，其中93.9%(31/33)阳性标本分布在华南海鲜市场的西区。

  经调查发现，华南海鲜市场名义上是海鲜市场，但实际上却是个综合市场。华南海鲜市场西区存在野生动物交易，尤其是西区的七街和八街靠近市场内部的区域存在多家野生动物交易商铺，而这一区域的阳性标本也比较集中，占全部阳性样本的42.4%(14/33)。“综上所述，高度怀疑此次疫情与野生动物交易有关。”许文波说。

  许文波表示，对核酸检验测试阳性的样本，病毒病所采用冠状病毒敏感细胞系开展了病毒分离工作，从电镜观察、PCR和深度测序结果均提示，成功从环境样本中分离到新冠病毒，进一步证实在华南海鲜城环境中存在着大量的新冠病毒2019-nCoV。

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