发布日期： 2024-02-14 05:32:45 来源：火狐体育葡萄牙合作下载
的确，就目前的数据分析来看，疑似病例的病毒核酸检验测试假阴性颇高，对于真是新冠病毒感染的病人，阳性率也只有30%-50%。因此很多人认为核酸检验测试不靠谱，也有医生提出建议以CT影像学检查阳性代替病毒核酸检验测试阳性来确诊。但是目前病毒核酸检验测试仍然是确诊标准，这是怎么回事呢？
“主要与流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、SARS冠状病毒等其他已知病毒性肺炎鉴别，与肺炎支原体、衣原体肺炎及细菌性肺炎等鉴别。此外，还要与非感染性疾病，如血管炎、皮肌炎和机化性肺炎等鉴别。”
由此可见，仅凭借CT影像学检查不能将新冠肺炎与以上病症有效鉴别，会存在误诊的情况，而误诊又会导致新的交叉感染。
医护人员采样——包装——运输至检测实验室——样本灭活——裂解——核酸提取——qPCR检测——出报告。
采样及运输环节、核酸提取环节和qPCR检测环节。任何一个环节存在一点问题，都会提高假阴性风险。现在我们分别来看
我们都知道下呼吸道样本含有病毒载量更多，但是由于采样不方便或者病人没有痰，现在采集的样本几乎都是上呼吸道样本，比如咽拭子。根据病人病程、医护人员取样操作的规范程度不同等原因，会出现采样量不均一问题，也就是量多量少的问题，采集的样本中病毒量少，假阴性的风险就高。
采样及运输环节，样本采集是一个重要的因素。运输环节，目前的包装和运输条件全部使用国家CDC 标准，对于样本质量的保证和风险都是一致的，我们暂且不做讨论。
注意，这个环节从样本灭活开始，到获得样本中RNA结束。而且样本具有特殊性。
目前送检样本以咽拭子为主，极少量痰液。咽拭子擦取的是两腭弓、咽及扁桃体部位的分泌物，
这种分泌物与痰液的共同特点是有黏度、蛋白多、不易液化，处理困难。如果有足量的样本，现有的核酸提取方法也不是问题（无非就是处理麻烦些，需要的样本量和试剂量比较大），问题就在于
咽拭子和痰液本身就很难处理，而且采集的样本量可能还非常少。对于核算检验测试假阴性，
现有观点主要考虑核酸纯化及qPCR，没考虑更靠前的样本处理的重要性，比如出于对检测工作员的安全防护，所有的样本在核酸提取之前都有必要进行56℃，30分钟的灭活处理。新冠病毒是RNA病毒，这一步灭活在某些特定的程度上可能会造成病毒核酸降解影响后续核酸提取的得率和质量，进而影响下游检验测试鉴定结果。再比如样本的裂解，使用裂解液裂解属于化学法裂解，如果单纯是细胞，化学裂解的效果是有保障的，但是如果是
咽拭子或痰液这类样本，化学裂解就很难裂解充分，导致病毒核酸释放不够，影响后续核酸提取得率（再是痕量样本，困难可想而知）。因此，在核酸提取环节，针对咽拭子或痰液这种难处理且微量/痕量的样本，解决方法才是影响病毒核酸提取得率的最主要的因素。
要有病毒核酸存在，qPCR才能检测出来。有专家在质疑检测试剂盒的质量以及检验测试手段，觉得应对不同厂商的试剂盒进行系统对比，我们赞成这个做法，因为不排除有试剂盒原料、引物设计、产品质控手段及产品批次间有差异。但是我们也要为大部分试剂盒生产厂商和仪器生厂商说句公道线年，发展至今技术非常成熟，检验测试灵敏度可低至1个拷贝，是当今应用于临床的最先进的核酸分子诊断技术之一。因此，
在qPCR 检测环节，检测试剂盒是一个因素，还有一个影响因素是检测技术人员的技术水平。值得庆幸的是，这两个影响因素随着试剂盒质量和技术人员水平的不断的提高正在逐渐减少。
经过总结，我们显而易见，在整个新冠肺炎样本做核酸检验测试过程中，导致假阴性结果的重要的因素有4个：1、样本采集；2、病毒核酸提取前的样本处理方法；3、检测试剂盒质量；4、操作人员水平。
我们前面说过了，3和4这两个因素一直在改善，目前和未来都不可能会成为最关键的因素。
样本采集和病毒核酸提取之前的样本处理方法。也就是说如果没有采集到样本或者没有提取到病毒的核酸分子，再牛的检测试剂盒结果也只能是阴性。临床样本采集有先天的局限性，可以说有很大一部分的假阴性是因为只采集到一点点的带病毒样本，这一点点样本还有很多黏蛋白，很难裂解，想要提取到核酸还得能用于qPCR扩增能够说是十分艰难的，假阴性的结果也变成情理之中了。
每一份痕量珍贵的样本背后，都有一个亟待救治的患者，每一份检测报告的背后，都是不止一位检测工作者超过5个小时的风险操作。
也就是说在新冠肺炎病毒的整个检测环节中，做好核酸提取前的样本处理，从痕量难处理的样本中充分释放病毒核酸才是关键中的关键！改变核酸提取前的样本解决方法有可能使假阴性的概率降低！
在临床样本采集量有限的情况下，我们要把目光投放在核酸纯化前的样本处理上，即通过更有效的手段，比如使用聚焦超声技术的物理裂解方法结合化学裂解法对采集的样本做病毒灭活、匀浆或者液化处理，充分释放病毒核酸，使后续核酸纯化获得足够且高质量的病毒RNA，这是现有条件下提高检测灵敏度的根基，可以减低可疑或者假阴性结果。
在呼吸道合胞病毒（Human Respiratory Syncytial Virus, RSV）的鉴定案例中，作者比较了Covaris聚焦超声技术(AFA)（授权基因有限公司全国独家代理）处理痰液结合MNAzyme探针法与Glass beads研磨方法处理痰液结合TagMan探针法对RSV病毒提取及扩增效率的影响。结果显示，与Glass beads方法相比，经Covaris AFA超声法处理后提取的核酸样本，检测到的Ct值明显减小(变化范围1.0 - 4.0 log，灵敏度提高10-10000倍)，即经Covaris AFA超声法处理的样本提取的病毒RNA得率更高。尤其是在7号样品中，使用Glass beads方法处理的样本，检测RSV-B呈阴性，而Covaris方法处理的样本检测结果为阳性。（如下表）
Covaris AFA超声法（授权基因有限公司全国独家代理）处理痰液的时间仅仅是30秒。这是因为聚焦超声技术的声波频率（500kHz）远高于普通水浴超声，集中的能量可以在低温条件下几分钟内将病毒彻底灭活，同时充分释放病毒核酸以便于提高病毒核酸得率。既可保护检测工作员的安全，又能大大的提升工作效率，降低假阴性概率。下面这个分枝杆菌鉴定的案例，也充分证明了这一点。
分枝杆菌在自然界中都会存在，在临床上，可引发个体全身或局部的破坏性感染。由于不一样的种类的分枝杆菌感染需要不同的治疗方案，因此菌株的快速准确鉴定对于疾病诊断和有效的抗生素治疗至关重要。
常规方法（高温灭活和珠子处理）完成一次菌株灭活及多肽提取需要95.5分钟，其中95℃灭活30分钟，使用聚焦超声技术完成一次菌株灭活及多肽提取仅需4.5分钟，其中18℃灭活仅需2分钟，接受测试的21个种属182份样品在2分钟处理条件下完全灭活。比传统方法节约28分钟。
处理后的样本使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行检验确定。结果显示，利用Covaris AFA技术处理的样本鉴定所得到的平均置信度得分Log值为2.07(1.90-2.26)，而传统方法提取鉴定的平均得分为1.96(1.52-2.20)。并且，当使用≥2.0作为cut-off临界值时，AFA鉴定的准确率为66.7%，而传统方法则为41.7%；当分别以≥1.8和≥1.7作为cut-off临界值时，传统方法的准确率为66.7%和83.3%，
（注：得分表示未知样品的质谱图谱与数据库中已知样品的图谱的相似程度，Log值越高，表明待测样品的细菌蛋白质鉴定的灵敏性和准确度越高）
同时作者还发现，使用Covaris AFA聚焦超声处理的菌株，在鉴定时的重复性也远高于传统处理方法。具体表现为：
由此可见，对于常规方法难以获得理想提取效果的临床样本，比如新冠肺炎的咽拭子或痰液样本，
只需要在核酸提取之前加一步Covaris AFA超声处理（授权基因有限公司全国独家代理），即可在极短时间内将病毒完全灭活且不影响RNA 提取质量，充分释放医学样本中的病毒核酸，提高后续病毒核酸提取得率，从源头上提高检测灵敏度，降低假阴性概率。
Covaris 自动聚焦声学技术 (Adaptive Focused Acoustics，AFA) （授权基因有限公司全国独家代理）作用于微量珍贵临床样本，可以有效提升核酸得率。该技术整合了非线性、高强度、会聚性声学冲击波和高级计算机控制管理系统。通过圆盘状传感器将声波能量聚焦在样品上，且能量强度可控，采用非接触并等温的方式来进行样品的匀浆或混匀。
Adaptive Focused Acoustics，AFA如果您的实验室里有Covaris AFA 样本处理系统，并且您的实验室正在进行新冠肺炎病毒相关的检测工作，请联系基因有限公司技术上的支持团队，我们愿意为您提供我们能力范围内最大的支持，与您一起，攻克难关。
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