高纯度质粒小提中量试剂盒操作方法及步骤说明书

  高纯度质粒小提中量试剂盒操作方法及步骤说明书 ◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ 目录号 RP02 ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外 ◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ 目录号 RP02 ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外 ◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ 目录号 RP02 ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外   高纯度质粒小提中量试剂盒 目录号：PL1801 ? 适合使用的范围： 适用于5-15ml 中等规模质粒制备（mind preparati...

  ◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ 目录号 RP02 ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外 ◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ 目录号 RP02 ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外 ◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ 目录号 RP02 ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外   高纯度质粒小提中量试剂盒 目录号：PL1801 ? 适合使用的范围： 适用于5-15ml 中等规模质粒制备（mind preparations） ? 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成 保存 50次 平衡液 室温 5ml RNase A（10mg/ml） －20℃ 250μl 溶液P1 4℃ 25 ml 溶液P2 室温 25 ml 溶液P3 室温 35 ml 去蛋白液PE 室温 16ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 漂洗液WB 室温 15 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液EB 室温 10ml 吸附柱AC 室温 50个 收集管（2ml） 室温 50个       本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 储存事项: 1. 第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液P1后（终浓度100ug/ml）置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会出现微量RNA残留，在溶液P1中补加RNase A即可。 2. 环境和温度低时溶液P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，就可以恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。 ? 产品介绍： 本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 ? 产品特点： 1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2. 独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌株如JM系列、HB101也可以轻松去除。有很大效果预防了质粒被核酸酶降解。 3. 快速、方便，不需要用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好， 可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。 ? 需要注意的几点 1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速能够达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2. 溶液P3和去蛋白液PE中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。 3. 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素相关。一般高拷贝质粒，建议取5-15 ml 过夜培养14-16个小时的菌液，可提取出多达50μg-60μg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用10-20 ml过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步骤相同。 4. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计

  浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。 5. 质粒DNA确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才不难得知。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。 6. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也能够正常的使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－20℃。质粒DNA若需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能会影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。 ? 关于平衡液的使用 1. 介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大幅度减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。来提升硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至37℃使沉淀完全消失。 2. 使用方法：取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。 ? 操作步骤：（实验前请先阅读需要注意的几点） 提示： ? 第一次使用前请先在漂洗液WB和去蛋白液PE瓶中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入! ? 将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。 ? 将溶液P3放在冰上预冷。 1. 取5-15 ml过夜培养的菌液，9,000rpm离心1-2分钟，尽可能的倒干上清，收集菌体。 2. 用500μl溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮，全部转入一个2ml离心管。 如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 3. 加500μl的溶液P2，温和地上下翻转4 -7次使菌体充分裂解，室温放置4分钟。 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。 4. 加700μl溶液P3，立即温和地上下翻转4 -7次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。冰上静置3-5分钟，13,000rpm离心10分钟，小心取上清。 加入溶液P3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 平衡液预处理吸附柱： 使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前文“关于平衡液的使用” 5. 将上一步所得上清分次加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中）， 13,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。 6. 可选步骤:加入500μl去蛋白液PE，13,000rpm 离心30-60秒，弃废液。 此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量丰富，应加此步骤；如所用菌株为XL-1 Blue和DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可略过此步骤。 7. 加入600μl漂洗液WB（请先检查是不是已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。 8. 加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。 9. 将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 10. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl-250洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。若需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。 洗脱体积越大，洗脱效率越高。若需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应该少于80μl，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。 ? 问题与解决办法 问题 评论与建议 质粒DNA产量低 *忘加抗生素，非质粒转化细胞过度生长-建议：确保固体、液体培养基中都加入了适当的抗生素。 *细菌培养时间太长，老化细菌开始裂解-建议：接种过夜培养的新鲜单菌落于加了合适抗生素的培养基中，培养12-16个小时。 *使用了低拷贝数质粒-建议：使用高拷贝数质粒，低拷贝数质粒应该适当加大处理体积。 *细菌培养时间过短，细菌浓度过低-建议：细菌培养到[A600]吸光值为2-4时，收集菌体。 *细菌细胞裂解不完全-建议：使用建议的菌体处理量，不要过量；涡旋或者吹打，确保菌体充分重悬于溶液P1中，不应该见到未散开的细菌团块；加入裂解液P2后，应该是粘稠和透明的。 *质粒DNA产量使用分光光度计定量不准确-建议：分光光度计定量常常偏高，使用琼脂糖电泳/EB染色定量。 *洗脱效率不高-建议：请阅读操作步骤9和需要注意的几点6。 未提取到质粒DNA *漂洗液WB中忘加无水乙醇-建议：第一次实验时，在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇 *质粒洗脱液含有较多乙醇，琼脂糖电泳/EB染色定量时质粒DNA漂出上样孔-建议：确保已经做了步骤9，将离心吸附柱的残留乙醇去除；或者适当提高上样缓冲液浓度。。     问题 评论与建议 质粒DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全 *忘记做步骤9，乙醇抑制了酶切反应-建议：做步骤9，然后空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。 *一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应-建议：将洗脱的回收DNA溶液13,000rpm再离心1分钟，小心取上清使用。 质粒DNA降解或者无质粒DNA *核酸酶活性太高-建议：确保已经做了步骤6，使用去蛋白液PE去除核酸酶。 基因组DNA污染 *裂解时基因组DNA被剪切打断了-建议：做步骤3时，轻柔颠倒混匀，不要涡旋或者剧烈震荡。 质粒DNA缺口或者电泳时超螺旋带前出现变性质粒带 *步骤3裂解时间过长-建议：裂解时间别超过5分钟。 产物中含有RNA污染 *第一次做实验时，忘记将RNase A 加入P1溶液，RNase A失活或者起始处理量过量-建议：第一次实验前确保将RNase A加入了溶液P1；P1溶液超过3个月的，可加入一些新RNase A；处理量不要过量；菌体重悬于P1溶液后可放置几分钟让RNase A充分作用后再进行下一步。

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