发布日期： 2024-03-09 03:54:58 来源：ELISA试剂盒
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及基于磁珠法从全血、培养细胞、组织、唾液、G-细菌、G+细菌等常见临床样本中提取基因组DNA的核酸快速提取试剂盒及其提取方法。
核酸的分离与纯化技术是分子生物学实验的一项基本技术，从最初的目的基因提取到PCR产物纯化或“胶回收”、以及基因克隆中质粒的提取等实验过程，不能离开核酸提取纯化。核酸分离纯化技术起源于20世纪50年代，在70年代和80年代中传统的核酸沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍的应用和推广。常规的核酸提取方法涉及细胞裂解、有机溶剂萃取、沉淀和离心等步骤。这样的一个过程费时费力，不易自动化，且随着生物和医学技术的加快速度进行发展，原有的手工纯化核酸的方法，已经很难满足大规模、高通量的实验要求。
本发明针对现存技术核酸提取难以满足大规模、高通量的实验要求的问题，提高一种基于磁性分离技术的简便快速的磁性分离试剂盒。
具体方案为：核酸快速提取试剂盒，所述试剂盒内包括单独配制的混合酶工作液、裂解吸附液、洗涤液、漂洗液和洗脱液，所述混合酶工作液包括蛋白酶K和溶菌酶，所述裂解吸附液包括Gu-Hcl、Tris-Hcl、EDTA、异丙醇、SDS、Triton-100、β-巯基乙醇和柠檬酸钠，所述洗涤液包括Licl、Nacl、MOPS和乙醇，所述漂洗液为乙醇，所述洗脱液为EDTA和Tris-Hcl。
其中，Gu-Hcl为盐酸胍，Tris-Hcl的别名为三(羟甲基)氨基甲烷、氨丁三醇、缓血酸铵或者三羟甲基氨基甲烷，分子式为C4H11NO3；EDTA为乙二胺四乙酸，分子式为C10H16N2O8；SDS为十二烷基硫酸钠；Triton-100为的别名为聚乙二醇辛基苯基醚或者聚氧乙烯辛基苯基醚，Licl为氯化锂，MOPS为3-(N-吗啉)丙磺酸。
进一步的，所述混合酶工作液中，蛋白酶K的浓度为10~40mg/mL，溶菌酶的浓度为10~40mg/mL。
核酸快速提取试剂盒的使用方法，包括以下步骤：步骤一、用试管取100μL样本，加入10μL混合酶工作液，56℃水浴5min；
步骤二、加入750μL裂解吸附液和磁性纳米微球，上下颠倒试管5-10次充分混合，在室温下放置3min；
步骤六、室温放置3min，挥干乙醇，加入100μL洗脱液上下吹打沉淀，使微球充分悬浮，在室温下放置3min，得纯化的DNA。
磁珠法核酸运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表明上进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠，该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合，利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的DNA和RNA分离出来，可应用在临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。
本发明的提取试剂盒和实验方法具有如下优点：1、价格低，可以适用于多种样本如：全血、培养细胞、组织、唾液、G-细菌、G+细菌等基因组DNA的提取；2、本体系提取所得DNA纯度高，可适用于下游的酶切和PCR生物操作；3、本体系不需要离心操作、特殊的实验条件和昂贵的仪器设施且易于实现自动化；4、本体系所用试剂性质稳定，适用于一般实验室的需求，同时还克服了传统方法有毒、耗时长、操作繁琐等缺点。
通过下面实施例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围，不局限于此。
步骤一、取100μL抗凝血，加入10μL混合酶工作液，56℃水浴5min。
步骤二、加入750μL裂解吸附液和适量磁性纳米微球上下颠倒试管5-10次充分混合后室温放置3min。
步骤六、室温放置3min，挥干乙醇，加入100μL洗脱液上下吹打沉淀使微球充分悬浮后在室温下放置3分钟，得纯化的DNA。
实施例2与实施例1的区别仅在于蛋白酶K的浓度为20mg/mL，溶菌酶的浓度为20mg/mL。
实施例3与实施例1的区别仅在于蛋白酶K的浓度为40mg/mL，溶菌酶的浓度为40mg/mL。
步骤二、取稀释后的样本液100μL，加入10μL混合酶工作液，56℃水浴5min。
步骤三、加入750μL裂解吸附液和适量磁性纳米微球上下颠倒试管5-10次充分混合后室温放置3min。
步骤七、室温放置3min，挥干乙醇，加入100μL洗脱液上下吹打沉淀使微球充分悬浮后在室温下放置3分钟，得纯化的DNA。
以实施例2，同类试剂盒、Takara DL2000 DNA Marker和生理盐水做对比实验，如图1所示，图1为利用本发明试剂盒和同类试剂盒提取的全血基因组DNA的电泳检测图。
总共有11个样孔，使用1~6样孔注入待检测的试剂，样孔1为DNA上样缓冲液（6×quadricolor-loading buffer）做的空白对照，样孔2、3内为本发明试剂盒提取到的全血基因组DNA样品，样孔4、5内为同类试剂盒提取到的全血基因组DNA样品，样孔6为Takara DL2000 DNA Marker样品，样孔对应泳道。如图1所示，泳道1为空白对照检测结果，泳道2、3为本发明试剂盒提取到的全血基因组DNA检测结果，泳道4、5为同类试剂盒提取到的全血基因组DNA检测结果，泳道6为Takara DL2000 DNA Marker，2、3泳道的DNA条带亮度明显强于4、5泳道，说明在相同上样量的前提下，本试剂盒提取所得DNA样品的浓度明显优于同类产品。
在DNA质量方面，本试剂盒提取的基因组DNA样品纯度高，蛋白含量低，盐残留少，可直接用于PCR扩增；在DNA提取时效方面，本试剂盒单次提取时间在30min左右，优于国内众多试剂盒。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不可能影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书里面的具体实施方式等记载能够适用于解释权利要求的内容。
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