植物过氧化物酶(POD)ELISA试剂盒

  捕获抗体的包被微孔中，顺次参加标本、规范品、HRP符号的检测抗体，经过温育并完全洗刷。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的效果下转化成终究的黄色。色彩的深浅和样品中的呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），核算样品浓度。

  1.本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、安排匀浆及相关液体样本中过氧化物酶(POD)的含量；

  1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过一晚后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应防止重复冻融。

  2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本搜集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应防止重复冻融。

  3.细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应防止重复冻融。 (注：标本溶血会影响**检测成果，因而溶血标本不宜进行此项检测。)

  标本的稀释准则：首要经过文献检索的办法了解待测样本的大致含量，确认恰当的稀释倍数。只要稀释至规范曲线的规模内，检测的成果才是精确的。稀释的进程中，应做好具体的记载。核算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。

  规范品的稀释准则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后重复倒置/搓动以助溶解，其浓度为300 pg/ml，做系列倍比稀释后，别离稀释300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，样品稀释液直接作为规范浓度0 pg/ml，临用前15分钟内制造。 如制造150 pg/ml规范品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述规范品参加含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其他浓度以此类推。

  生物素符号抗体的稀释准则：临用前以生物素符号抗体稀释液稀释，稀释前依据预先核算好的每次试验所需的总量制造（每孔100μl），实践制造时应多制造0.1-0.2ml。如10μl生物素符号抗体加990μl生物素符号抗体稀释液的份额制造，悄悄混匀，在运用前一小时内制造。

  辣根过氧化物酶符号亲和素的稀释准则：临用前以辣根过氧化物酶符号亲和素稀释液稀释，稀释前依据预先核算好的每次试验所需的总量制造（每孔100μl），实践制造时应多制造0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶符号亲和素加990μl辣根过氧化物酶符号亲和素稀释液 的份额制造，悄悄混匀，在运用前一小时内制造。

  试验开端前，请提早装备好一切试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽可能的防止起泡。每次检测都应该做规范曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品契合试剂盒的检测规模。

  1.加样：别离设空白孔、规范孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔别离加规范品或待测样品100μl，留意别有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，悄悄晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反响120分钟。 为确保试验成果有效性，每次试验请运用新的规范品溶液。

  2.弃去液体，甩干，不必洗刷。每孔加生物素符号抗体工作液 100μl（取1μl生物素符号抗体加99μl生物素符号抗体稀释液的份额制造，悄悄混匀，在运用前一小时内制造），37℃,60分钟。

  3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

  4.每孔加辣根过氧化物酶符号亲和素工作液（同生物素符号抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。

  5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

  6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此刻肉眼可见规范品的前3-4孔有显着的梯度蓝色，后3-4孔梯度不显着，即可停止）。

  7.依序每孔加停止溶液50μl，停止反响（此刻蓝色立转黄色）。停止液的参加次序应尽量与底物液的参加次序相同。为了可以更好的确保试验成果的精确性，底物反响时间到后应赶快参加停止液。

  8.用酶联仪在450nm波长依序丈量各孔的光密度（OD值）。 在加停止液后15分钟以内进行检测。

  1.用户在初度运用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂会集到管底。

  2.每次试验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，仅仅**加底物溶液及2N H2SO4。丈量时先用此孔调OD值至零。

  3.为防止样品蒸腾，试验时将反响板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。

  4.未运用完的酶标板或许试剂，请于2-8℃保存。规范品、生物素符号抗体工作液、辣根过氧化物酶符号亲和素工作液请依据所需的量装备运用。请勿重复运用已稀释过的规范品、生物素符号抗体工作液或、辣根过氧化物酶符号亲和素工作液。

  手艺洗板办法：吸去（不行触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在试验台上衬托几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几回；将引荐的洗刷缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。依据本身的需求，重复此进程数次。

  以规范物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（一般坐标），在半对数坐标纸上绘出规范曲线，依据样品的OD值由规范曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用规范物的浓度与OD值核算出规范曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，核算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实践浓度。

  4.请每次测定的一起做规范曲线.如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，核算时请乘以稀释倍数。

  搜集标本前有必要清楚要检测的成份是否满足安稳。对搜集后当天进行细心的检测的标本，储存在4 ℃备用，如有特别原因要周期搜集标本， 将标本及时分装后放在-20 ℃或-70 ℃条件下保存。防止重复冻融。标本2 -8 ℃可保存48 小时，-20 ℃可保存1 个月。-70度可保存6 个月。部分激素类标本需增加抑肽酶。

  以规范物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出规范曲线，依据样品的OD值由规范曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用规范物的浓度与OD值核算出规范曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，核算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实践浓度。