发布日期： 2024-03-26 03:10:01 来源：新产品展示
【专利摘要】本发明公开了一种FT4体外诊断试剂盒，本发明对那些极性强，分子量小的半抗原无法包被于固相载体进行仔细的检测，提供了一种使用起来更便捷的试剂盒，解决了半抗原包被不佳的情况，便于快速、灵敏的进行FT4的检测。
[0001]本发明涉及一种FT4检测试剂盒，具体涉及一种FT4体外诊断试剂盒及其使用方法。
[0002]游离甲状腺激素(Free Thyroid Hormone, FT4)评价甲状腺功能和研究下丘脑-垂体-甲状腺轴的主要指标之一。FT4是甲状腺激素的生物活性部分，能直接反映甲状腺功能状态，并且不受血中甲状腺素结合球蛋白(TBG)浓度及结合力改变的影响。甲亢时FT4测定数值明显高于正常范围；甲低时明显低于正常范围。慢性活动性肝炎，原发性肝汁性肝硬化也会引起FT4的下降。妊娠36周以后FT4正常生理性降低。
[0003]FT4以前一直用放射免疫分析(RIA)，放射免疫分析它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，因此能精确测定各种具有免疫活性的极微量的物质，但是放射免疫分析存在放射线辐射和污染等问题，用ELISA方法快速简便，既有放射免疫分析的优点，同时也减少了污染。
[0004]竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和固相抗原竞争结合酶标抗体，因此结合于固相的酶标抗体量与受检抗原的量成反比。操作步骤如下:(1)将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原。洗涤。(2)待测管中加受检标本和一定量酶标抗体的混合溶液，使之与固相抗原反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗体能顺利地与固相抗原结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗体以同样的机会与固相抗原结合，竞争性地占去了酶标抗体与固相载体结合的机会，使酶标抗体与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗体，保温后，酶标抗体与固相抗原的结合可达最充分的量。洗涤。
(3)加发光液显色:参考管中由于结合的酶标抗体最多，信号值最高。参考管信号值与待测管信号值的大小，代表受检标本抗原的量。待测管信号值越低，表示标本中抗原含量越多。
[0005]由于半抗原都是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白耦联是很重要的。
[0006]通常在市面上比较多的FT4试剂盒有放免试剂盒以及ELISA试剂盒，放免试剂盒存在诸多的地方，包括以下方面:
某些放射性同位素由于半衰期短不利于储存和运输，同时由于放射性物质的污染对工作人员的健康以及环境也造成了一定的危害，需要特殊的防护以及废物回收处理等设备，大大的增加了成本。
[0007]二，灵敏度。通常ELISA试剂盒的分析灵敏度可达到10_13mol/L，固相放免试剂盒的分析灵敏度刻达到10_16mOl/L。
[0009]本发明的目的是针对上述存在的缺陷而提供一种FT4体外诊断试剂盒及其使用方法。本发明对那些极性强，分子量小的半抗原无法包被于固相载体进行仔细的检测，提供了一种使用起来更便捷的试剂盒，解决了半抗原包被不佳的情况，便于快速、灵敏的进行FT4的检测。
[0010]本发明的一种FT4体外诊断试剂盒及其使用方法技术方案为，该FT4体外诊断试剂盒，包括微孔板、校准品、质控品、酶结合物、发光底物液和浓缩洗涤液；其中微孔板中含有小分子半抗原FT4耦联载体蛋白得到的小分子耦联蛋白；校准品与质控品为已知浓度的FT4抗原；酶结合物中含有FT4酶标抗体。
[0011]发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶稳定剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。
[0012]微孔板中含有的小分子耦联蛋白，是将小分子半抗原FT4耦联载体蛋白BSA得到的小分子耦联蛋白。
[0013]所述的小分子耦联蛋白，为使用EDC将小分子半抗原FT4和载体蛋白BSA进行耦联得到的小分子耦联蛋白。
③将2-4体积份的EDC溶液与5-10体积份BSA溶液混合后，加入与EDC等量的NHS溶液，室温反应10-20分钟，后再加入1-2体积份的EDC ;再室温反应10-20分钟；
⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的小分子半抗原FT4，室温反应1.5-3小时；
⑦加入脱盐柱，将里面的储存液排出，然后加入PBS以同样的转速离心3-5次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物。
[0016]步骤②中EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，BSA用活化缓冲液溶解，终浓度为4.5-5.5mg/mL。
④线]其中，步骤①中的包被液为，氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠的混合水溶液，其中还可以含有防腐剂。
①分别往微孔板中加入校准品、质控品和待测样本，再往微孔板中加入酶结合物，充分混匀,37 0C反应50-80分钟；②加入洗涤液洗涤3-6次，每次加洗涤液量为300-400uL；
③然后向微孔板中加入发光底物液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据，得出待测样本中小分子半抗原FT4的量。
[0021]浓缩洗涤液加纯水稀释为洗涤液(例:20X浓缩洗涤液50ml+950ml的纯水即为IX洗涤液)。
[0022]本发明的有益效果为:本发明的试剂盒使用起来更便捷，本发明运用化学发光法定量检测，可以使其检验测试范围更加宽广，增加它的灵敏度，精密度实验也优于一般的ELISA方法。而对比市面上的化学方法定量检测试剂盒，本发明试剂盒用的为间接法，通过包被小分子半抗原，采用竞争法检测FT4。
[0023]小分子抗原，又称为半抗原，这些小分子本身没有免疫原性，当与载体结合后形成大分子，能够得到免疫原性。半抗原与载体形成的免疫原，当半抗原分子量极小，或则极性较大时，小分子抗原往往不容易直接固相吸附于板条上，使用BSA偶联小分子，能形成较大的分子量，通过疏水作用就容易吸附于固相载体上，这样的方法灵敏度较高，高度的特异性和灵敏性，能使分析过程简化。
[0024]EDC将FT4和载体进行耦联。EDC能与载体蛋白BSA形成一种活泼的酯结构，半抗原FT4的基团上有羧基基团，能使之与BSA-EDC反应，能形成BSA-FT4偶联物。
[0025]采用竞争法检测小分子半抗原FT4，该方法的好处在于简单易操作，一步完成，包被正常情况下不会出现过量包被造成IC50值(被抑制一半时抑制剂的浓度)较高，并且游离的抗原更容易和标记的抗体进行反应，灵敏度和精确度较高。而采用包被抗体的方法非常容易导致包被过量影响IC50值，并且小分子的标记通常不能采用经典的过碘酸钠法，需要采用其他的化学方法，EDC0 NHS/EDC等，对酶的活性有一定的影响。
1.非放射性化学发光试剂盒则完全抛弃了放射性同位素，因此不仅消除了对环境和操作者的危害，而且也使试剂的稳定性和有效期大大的延长。同时由于发光信号可以再短时间内自行消失，因此容易实现连续，动态，重复测定。
[0027]2.高灵敏度化学发光试剂盒的分析灵敏度可达到10_18mol/L。如果每次以加样量为50ul，按摩尔常数为6.02X1023计算，此时样本中仅有几十个待测分子，这个灵敏度已达到了免疫检测技术的极限了。
[0028]3.长有效性化学发光完全抛弃了放射性同位素，因此彻底摆脱了半衰期的限制，使试剂的稳定性以及有效期大大的延长了。化学发光的试剂盒能够达到I年多。
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
①平衡EDC (1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，NHS (N-羟基丁二酰亚胺)至室温。
[0032]②将EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为50mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为50mg/mL，BSA (牛血清白蛋白)用活化缓冲液溶解，终浓度为5mg/mL。
[0035]⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的蛋白(小分子半抗原FT4)，室温反应2小时。
[0037]⑦加入脱盐柱，脱盐柱先以1000g，2min将里面的储存液排出，然后加入0.0lMPBS以同样的转速离心4次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物。
[0039]③洗涤一次后，放入线]其中，步骤①中的包被液为，IL纯水中含有氯化钠8.5g，磷酸二氢钠0.58g，磷酸氢二钠5.8g。
用FT4酶标抗体、酶稀释液(20%小牛血清混合于pH7.4的PBS溶液中)配制成一定浓度的酶结合物。
①分别向微孔板中加入50uL校准品、质控品和待测样本，再往微孔板中加入IOOuL酶标抗体，分别与校准品、质控品和待测样本充分混匀，37°C反应60分钟。
[0045]②浓缩洗涤液加纯水稀释为I X洗涤液(例:20 X浓缩洗涤液50ml+950ml的纯水即为IX洗涤液)，加入洗涤液洗涤四次，每次加洗涤液量为350UL。
[0046]③然后向微孔板中加入发光底物液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据得出待测样本中FT4抗原的量。
[0047]发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶温度剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。
1.一种FT4体外诊断试剂盒，其特征是，包括微孔板、校准品、质控品、酶结合物、发光底物液和浓缩洗涤液；其中微孔板中含有小分子半抗原FT4耦联载体蛋白得到的小分子耦联蛋白；校准品与质控品为已知浓度的FT4抗原；酶结合物中含有FT4酶标抗体。
2.根据权利要求1所述的FT4体外诊断试剂盒，其特征是，发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶稳定剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。
3.根据权利要求1所述的FT4体外诊断试剂盒，其特征是，微孔板中含有的小分子耦联蛋白，是将小分子半抗原FT4耦联载体蛋白BSA得到的小分子耦联蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种FT4体外诊断试剂盒，其特征是，所述的小分子耦联蛋白，为使用EDC将小分子半抗原FT4和载体蛋白BSA进行耦联得到的小分子耦联蛋白。
5.根据权利要求4所述的FT4体外诊断试剂盒，其特征是，将小分子半抗原FT4和载体蛋白BSA进行耦联具体方法为: ①平衡EDC，NHS至室温； ②将EDC、NHS、BSA分别用活化缓冲液溶解； ③将2-4体积份的EDC溶液与5-10体积份BSA溶液混合后，加入与EDC等量的NHS溶液，室温反应10-20分钟，后再加入1-2体积份的EDC ;再室温反应10-20分钟； ④加入巯基乙醇终止EDC反应，得到活化蛋白EDC-BSA； ⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的小分子半抗原FT4，室温反应1.5-3小时；` ⑥加入Tris终止反应，得到耦联蛋白BSA-FT4； ⑦加入脱盐柱，将里面的储存液排出，然后加入PBS以同样的转速离心3-5次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物。
6.根据权利要求5所述的FT4体外诊断试剂盒，其特征是，步骤②中活化缓冲液包括:0.1M 的 MES，0.5M 的 NACl，调节 pH 为 6.0。
7.根据权利要求5所述的FT4体外诊断试剂盒，其特征是，步骤②中EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为45_55mg/mL，BSA用活化缓冲液溶解，终浓度为4.5-5.5mg/mL。
8.根据权利要求5所述的FT4体外诊断试剂盒，其特征是，步骤⑥中Tris为20-50mmol /I,η
9.根据权利要求5所述的FT4体外诊断试剂盒，其特征是，耦联好的蛋白包被方式制备试剂盒，步骤为: ①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小时； ②甩干板条，加入封闭液，37度放置2小时； ③洗漆一次后，放入线小时； ④线体外诊断试剂盒的使用方法，其特征是， ①分别往微孔板中加入校准品、质控品和待测样本，再往微孔板中加入酶结合物，充分混匀,37 0C反应50-80分钟； ②加入洗涤液洗涤3-6次，每次加洗涤液量为300-400uL； ③然后向微孔板中加入发光底物液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据，得出待测样本中小分子半抗原FT4的 量。
【发明者】穆海东, 汪宁梅, 陈福美, 沈珏璟 申请人:上海裕隆医学检验所股份有限公司
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