发布日期： 2023-11-30 17:53:36 来源：火狐体育全站官网app
小鼠 IL-1 ELISA 用途： IL-1是一种单核因子。1972年Gery等发现人白细胞培养的上清中含有一种可溶性物质，这 种物质可促进小鼠胸腺细胞对植物血凝素(PHA)的有丝分裂反应。 起初命名为淋巴细胞激活 因子(lymphocyte-activating factor, LAF)或内源性热原质(endogenous pyrogen)、 破骨 细胞激活因子 (osteoclast activating factor)、 黑素瘤细胞生长抑制因子 (melanomagrowth inhibitory factor)等，1979年国际统一命名为IL-1。 1. IL-1的产生 IL-1可由多种细胞合成和分泌。 (1)单核细胞、巨噬细胞(如腹腔粘连细胞peritoneal cell,PC)、 树突状细胞等在摄取 抗原抗体复合物后或在抗原提呈过程中可产生 IL-1。在大多数刺激剂刺激外周血单个核细 胞 (PBMC)条件下,IL-1β mRNA水平要高于IL-1α mRNA 20～25倍。 (2)小鼠巨噬细胞细胞系P388D1、J774、PU5-1.8、 WEHI-3以及人前单核细胞株U937等 在脂多糖(LPS)刺激后都能分泌大量的 IL-1。 (3)表皮细胞、NK细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞、脑胶质星状细胞、肾小球系 膜细胞(mesangial cell)、滑膜衬里细胞(synovial lining cell)、平滑肌细胞、上皮细胞、 胎盘细胞、白血病细胞、PMN等在某些条件下亦可产生IL-1。 许多因素可以直接影响单核-巨噬细胞IL-1的分泌:①细胞因子如巨噬细胞激活因子 (MAF)、集落刺激因子(CSF)、IFN-α、IFN-γ对IL-1产生具有增强作用。②LPS、PPD、BCG 和李斯特菌, 葡萄球菌、链球菌外毒素, 活病毒等也是IL-1产生的刺激剂。 在外周血中 20pg/ml内毒素刺激单核细胞即可产生IL-1，因此在一般培养条件下，由于微量内毒素的污 染可刺激单核细胞分泌IL-1。10ng/ml LPS可使单核细胞合成IL-1增加100倍。③蛋白激 酶C(PKC)的激活剂乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol myristate acetate, PMA)以及钙离子载体 (calcium ionophore)如A23187均具有着强烈的刺激作用。④和前列腺素则对IL-1 的产生有抑制作用。 2. IL-1 的分子结构和基因 完整的人 IL-1α和 IL-1β基因组分别为 10.5kb 和 7.8kb 。 人和小鼠 IL-1 基因定位于 2 号染色体，均含 7 个外显子。IL-1 前体(ProIL-1)为 31kDa，通 过蛋白水解酶裂解形成成熟的 IL-1 分子。IL-1 在不同种属中有较高同源性。在氨基酸水平 上，IL-1α 和 IL-1β 在不同种属同源性分别为 60 ％～70 ％和 75 ％～78 ％；但在同一种属中 IL-1α与 IL-1β 同源性只有25 ％。人IL-1α(PI5.0)和 IL-1β(PI7.0)分别由 159 和 153 个氨基酸 残基组成，分子量约 17.5kDa, 同源性为28 ％。IL-1 对糜蛋白酶敏感。 不同细胞所产生 IL-1 的等电点可有所差异。 本试剂盒用于定量检测小鼠血清、血浆、细胞培养上清液、组织液中的 IL-1 的浓度。 原理： 本试剂盒采用双抗夹心 ELISA 法。小鼠标本中的 IL-1 与生物素化的抗小鼠 IL-1 单抗结合， 并且生物素化的抗小鼠 IL-1 单抗上的生物素与酶标板上 Streptavidin 结合； 加入辣根过氧 化物酶标记的抗小鼠 IL-1，它将与小鼠IL-1 结合而形成免疫复合物。加入 TMB 显色。小鼠 IL-1 的浓度与OD(450nm)成正比。 试剂盒组成： 酶标板(Coated Wells) 96wells Anti-mouse IL-1 Biotin 6ml 浓缩洗涤液(20X)(Washing Concente) 25ml 标准品(Standards) 1 set 显色液 10ml Anti mouse IL-1 POD 6ml 终止液(Stop Solution) 10ml 需要但未提供的材料 1. 可在 450nm 处进行读数的酶标仪； 2. 能精确吸取 10-200µL 的移液器； 3. 可调多道（8 ）移液器（50－200µL ）； 4. 供可调多道移液器使用的试剂存放槽； 5. 洗瓶或洗板机； 6. 蒸馏水或去离子水； 7. 1 升的圆柱形量筒； 8. 移液器：1 和（10 或 25 mL ）； 9. 移液器枪头； 10. 纸巾； 11. 计时器，用以监控温育步骤； 12. 处理池和消毒剂（例如：0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水）； 需要注意的几点: 1. 严格依规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温 20-25 ℃。使用后立即冷藏保存试剂。 2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中 不要让微孔干燥掉。 3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。 4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不可以使用。 5. 避免试剂和标本的交叉污染防止造成错误结果。 6. 在储存和温育时避免强光直接照射。 7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。 8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。 任何漂白成分都会破坏 试剂盒中反应试剂的生物活性。 9. 不可以使用过期产品。 10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，依规定的程序处理样品和检测装置。 保存： 贮藏于 2-8°C 。 标本收集 1. 本试剂盒可使用血清、血浆、细胞培养上清液、组织液标本。 2. 室温 （20 －25 ℃）下保存标本别超过 8 小时。2 －10℃保存标本，不超过48 小时。如 耽搁的时间更长，请在-20℃或更低的温度下保存标本。标本避免多次冻融，这样可能 会损失蛋白活性，产生错误结果。 准备工作： 1. 浓缩洗涤液(20X)用双蒸水稀释成 1X(至 500ml) 。 操作步骤： 试剂盒应平衡至室温（20-25°C ）再试验。 取出所需反应板。 1. 加入 10ul 标准品(Standards)、10ul 标本于相应反应板孔中。 2. 每孔加入 40ul Anti mouse IL-1 Biotin 和 40ul Anti mouse IL-1 POD 。轻轻混匀30 秒，封 住板孔，室温温育 45 分钟。 3. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入 350ul 洗涤液），并去除水滴 （在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5 次。 4. 每孔加入 100ul 显色液， 轻轻混匀 10 秒，室温温育 20 分钟。 5. 每孔加入 100ul 终止液（Stop Solution）。轻轻混匀30 秒；30 分钟内在 450nm 处读 OD 值。 以OD 值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD 值可在标准曲 线上查出其浓度。 举例： ) 3.5 m n 3 0 5 2.5 4 ( e 2 c n 1.5 a b r 1 o s 0.5 b A 0 0 500 1000 1500 Conc. of mouse IL-1(pg/ml) 小鼠 IL-1a ELISA 用途： IL-1是一种单核因子。1972年Gery等发现人白细胞培养的上清中含有一种可溶性物质，这 种物质可促进小鼠胸腺细胞对植物血凝素(PHA)的有丝分裂反应。 起初命名为淋巴细胞激活 因子(lymphocyte-activating factor, LAF)或内源性热原质(endogenous pyrogen)、 破骨 细胞激活因子 (osteoclast activating factor)、 黑素瘤细胞生长抑制因子 (melanomagrowth inhibitory factor)等，1979年国际统一命名为IL-1。 1. IL-1的产生 IL-1可由多种细胞合成和分泌。 (1)单核细胞、巨噬细胞(如腹腔粘连细胞peritoneal cell,PC)、 树突状细胞等在摄取 抗原抗体复合物后或在抗原提呈过程中可产生 IL-1。在大多数刺激剂刺激外周血单个核细 胞 (PBMC)条件下,IL-1β mRNA水平要高于IL-1α mRNA 20～25倍。 (2)小鼠巨噬细胞细胞系P388D1、J774、PU5-1.8、 WEHI-3以及人前单核细胞株U937等 在脂多糖(LPS)刺激后都能分泌大量的 IL-1。 (3)表皮细胞、NK细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞、脑胶质星状细胞、肾小球系 膜细胞(mesangial cell)、滑膜衬里细胞(synovial lining cell)、平滑肌细胞、上皮细胞、 胎盘细胞、白血病细胞、PMN等在某些条件下亦可产生IL-1。 许多因素可以直接影响单核-巨噬细胞IL-1的分泌:①细胞因子如巨噬细胞激活因子 (MAF)、集落刺激因子(CSF)、IFN-α、IFN-γ对IL-1产生具有增强作用。②LPS、PPD、BCG 和李斯特菌, 葡萄球菌、链球菌外毒素, 活病毒等也是IL-1产生的刺激剂。 在外周血中 20pg/ml内毒素刺激单核细胞即可产生IL-1，因此在一般培养条件下，由于微量内毒素的污 染可刺激单核细胞分泌IL-1。10ng/ml LPS可使单核细胞合成IL-1增加100倍。③蛋白激 酶C(PKC)的激活剂乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol myristate acetate, PMA)以及钙离子载体 (calcium ionophore)如A23187均具有着强烈的刺激作用。④和前列腺素则对IL-1 的产生有抑制作用。 2. IL-1的分子结构和基因 完整的人IL-1α和IL-1β基因组分别为10.5kb和 7.8kb。人和小鼠IL-1基因定位于2号染色体，均含7个外显子。IL-1前体(ProIL-1)为31kDa， 通过蛋白水解酶裂解形成成熟的IL-1分子。IL-1在不同种属中有较高同源性。在氨基酸水 平上，IL-1α和IL-1β在不同种属同源性分别为60％～70％和75％～78％；但在同一种 属中IL-1α与IL-1β同源性只有25％。人IL-1α(PI5.0)和IL-1β(PI7.0)分别由159和 153个氨基酸残基组成，分子量约17.5kDa, 同源性为28％。IL-1对糜蛋白酶敏感。 不同 细胞所产生IL-1的等电点可有所差异。 本试剂盒用于定量检测小鼠血清中的 IL-1a 的浓度。 原理： 本试剂盒采用双抗夹心 ELISA 法。抗小鼠IL-1a单抗包被于酶标板上，小鼠标本中的IL-1a 会与单抗结合。加入生物素化的抗小鼠IL-1a（二抗），它将与结合在单抗上的小鼠IL-1a 结合而形成免疫复合物，未结合的将被洗去。辣根过氧化物酶标记的 Streptavidin 将与二抗 的生物素结合，多余的物质会被洗掉。加入 TMB 显色。小鼠 IL-1a 的浓度与 OD(450nm) 成正比。 试剂盒组成： 酶标板(Coated Wells) 96wells Anti-Mouse IL-1a Biotin 2 vials 浓缩洗涤液(100X)(Washing Concentrate) 10ml 标准品(Standards) 2 vials 显色液(TMB Substrate) 12ml 标准品稀释液(Standard Diluent) 15ml 终止液(Stop Solution) 12ml 浓缩酶联物（HRP ） 2 vials 酶联物稀释液(HRP Diluent) 15ml 生物素稀释液(Biotin Diluent) 15ml 需要但未提供的材料 1. 可在 450nm 处进行读数的酶标仪； 2. 能精确吸取 10-200µL 的移液器； 3. 可调多道（8 ）移液器（50－200µL ）； 4. 供可调多道移液器使用的试剂存放槽； 5. 洗瓶或洗板机； 6. 蒸馏水或去离子水； 7. 1 升的圆柱形量筒； 8. 血清移液器：1 和（10 或 25 mL ）； 9. 移液器枪头； 10. 纸巾； 11. 计时器，用以监控温育步骤； 12. 处理池和消毒剂（例如：0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水）； 需要注意的几点: 1. 严格依规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温 20-25 ℃。使用后立即冷藏保存试剂。 2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入 HRP 或底物前确保尽量吸干孔内液体。温 育过程中不要让微孔干燥掉。 3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。 4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不可以使用。 5. 避免试剂和标本的交叉污染防止造成错误结果。 6. 在储存和温育时避免强光直接照射。 7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。 任何漂白成分都会破坏 8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。 试剂盒中反应试剂的生物活性。 9. 不可以使用过期产品。 10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，依规定的程序处理样品和检测装置。 保存： 贮藏于 2-8°C 。 样品： 在此检测中，可使用血清样品。 准备工作： 1. 浓缩洗涤液(100X)用双蒸水稀释成 1X （至1000ml）。 2. 标准品用 1ml 标准品稀释液复溶。得到 2000pg/ml 的高浓度标准品。高浓度标准品可保 存于-20°C 。 3. 将 2000pg/ml 的高浓度标准品稀释成一组标准品，如： 1000, 500, 250, 125, 62.5, 0pg/ml 。 4. 配制 1x HRP：一支 HRP 加入 6 ml 酶联物稀释液，混匀。1x HRP 最好在临用前 15 分 钟配制。 5. 配制 1x Biotin：一支Biotin anti Mouse IL-1a 加入 6 ml Biotin 稀释液，混匀。1x Biotin 最好在临用前 15 分钟配制。 操作步骤： 试剂盒应平衡至室温（20-25°C ）再试验。 取出所需反应板。 临用前 15 分钟配制工作液 1. 加入 100ul 标准品(Standards)、100ul 血清于相应反应板孔中。 2. 轻轻混匀 30 秒，封住板孔，37°C 温育 60 分钟。 3. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入 350ul 洗涤液），并去除水滴 （在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5 次。 4. 每孔加入 100ul 1x Biotin。轻轻混匀30 秒，封住板孔，37°C 温育 60 分钟 5. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入 350ul 洗涤液），并去除水滴 （在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5 次。 6. 每孔加入 100ul 1x HRP。轻轻混匀30 秒，封住板孔，37°C 温育 30 分钟 7. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入 350ul 洗涤液），并去除水滴 （在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5 次。 8. 每孔加入 100ul TMB 显色液， 轻轻混匀 10 秒，37°C 暗处温育 15±10 分钟。 9. 每孔加入 100ul 终止液（Stop Solution)。轻轻混匀 30 秒；30 分钟内在 450nm 处读 OD 值。 以OD 值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据血清样品的OD 值可在标 准曲线上查出其浓度。 举例： 1.2 1 ) m 0.8 n 0 5 0.6 4 ( D 0.4 O 0.2 0 0 500 1000 1500 Conc. of mouse IL-1a(pg/ml) 注意事项： 1. 作标准曲线时，要扣除标准品稀释液造成的本底；如果标本用标准品稀释液稀释，也要 扣除标准品稀释液造成的本底，如果标本未用标准品稀释液稀释，标本不需扣除标准品 稀释液造成的本底。 2. 生物素(Biotin anti Mouse IL-1a) 和浓缩酶联物(HRP)用前应离心，使液于管底。 小鼠 IL-2 ELISA 用途： 1976年Morgan等发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子，由于这种 因子能促进和维持T细胞长期培养, 称为T细胞生长因子 (T cell growth factor, TCGF),1979年统一命名为白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)。 1. IL-2的产生 IL-2主要由T细胞或T细胞系产生。 (1)CD4阳性或CD8阳性T细胞:有丝分裂原刺激CD4阳性或CD8阳性T细胞亚群均可产 生 IL-2同种异体抗原主要刺激 CD4阳性T细胞分泌IL-2。PBMC、脾脏、淋巴结和扁桃腺中 的T细胞受到刺激后都能产生IL-2。在小鼠Th细胞中，只有Th1亚群可产生IL-2。 (2)T细胞肿瘤细胞系或白血病细胞系: 人和动物某些T细胞白血病细胞系或肿瘤细胞 在有丝分裂原、钙离子载体(如 A23187) 或 PMA刺激下可产生高水平的IL-2。如长臂猿T 细胞系MLA144可自发产生IL-2,小鼠胸腺瘤细胞系EL-4和人Jurkat细胞静止状态不合成 和分泌IL-2,刺激后可分泌高水平的IL-2。 (3)T淋巴细胞杂交瘤: T淋巴细胞杂交瘤123,FS6-14.13, HT-24A等在ConA刺激下产 生 IL-2。 (4)应用基因工程技术制备: 1983年Taniguchi等从ConA刺激的Jurkat白血病T细胞 中克隆成功 IL-2cDNA，并在大肠杆菌中得到高水平的表达。目前应用基因工程技术所制备 和纯化的IL-2已用于临床治疗某些肿瘤和其它疾病。 2. IL-2的分子结构和基因 人IL-2含有133氨基酸残基，分子量为15.5kDa。天然 IL-2 在N端含有糖基，但糖基对IL-2的生物学活性无明显影响，等电点在6.6～8.2。 IL-2 分子含有3个半胱氨酸，分别位于第58、105和125位氨基酸，其中58位与105位半胱氨 酸之间所形成的链内二硫键对于保持IL-2生物学活性起及其重要的作用。在IL-2基因产物的提纯 和复性过程中，如二硫键配错或分子间形成二硫键都会降低IL-2的活性。现已有应用点突 变， 将第125号位半胱氨酸突变为亮氨酸或丝氨基，使只能形成一种二硫键，保证了在IL-2 复性过程的活性。还有报道用蛋白工程技术生产新型rIL-2，将IL-2分子第125位半胱氨 酸改为丙氨酸, 改构后IL-2比活性比天然IL-2显著增加。人IL-2基因定位于第4号染色 体，长约5kb，由４个外显子和3个内含子组成。人和小鼠IL-2基因DNA序列有63％同源 性。 本试剂盒用于定量检测小鼠血清中的 IL-2 的浓度。 原理： 本试剂盒采用双抗夹心 ELISA 法。抗小鼠 IL-2 单抗包被于酶标板上，小鼠标本中的 IL-2 会与单抗结合。加入生物素化的抗小鼠IL-2（二抗），它将与结合在单抗上的小鼠IL-2结 合而形成免疫复合物，未结合的将被洗去。辣根过氧化物酶标记的 Streptavidin 将与二抗的 生物素结合，多余的物质会被洗掉。加入 TMB 显色。小鼠 IL-2 的浓度与 OD(450nm)成正 比。 试剂盒组成： 酶标板(Coated Wells) 48wells Anti-mouse IL-2 Biotin 1 vial 浓缩洗涤液(100X)(Washing Concentrate) 5ml 标准品(Standards) 1 vial 显色液(TMB Substrate) 6ml 标准品稀释液(Standard Diluent) 7ml 终止液(Stop Solution) 6ml 浓缩酶联物（HRP ） 1 vial 酶联物稀释液(HRP Diluent) 7ml 生物素稀释液(Biotin Diluent) 7ml 需要但未提供的材料 1. 可在 450nm 处进行读数的酶标仪； 2. 能精确吸取 10-200µL 的移液器； 3. 可调多道（8 ）移液器（50－200µL ）； 4. 供可调多道移液器使用的试剂存放槽； 5. 洗瓶或洗板机； 6. 蒸馏水或去离子水； 7. 1 升的圆柱形量筒； 8. 血清移液器：1 和（10 或 25 mL ）； 9. 移液器枪头； 10. 纸巾； 11. 计时器，用以监控温育步骤； 12. 处理池和消毒剂（例如：0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水）； 需要注意的几点: 1. 严格依规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温 20-25 ℃。使用后立即冷藏保存试剂。 2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入 HRP 或底物前确保尽量吸干孔内液体。温 育过程中不要让微孔干燥掉。 3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。 4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不可以使用。 5. 避免试剂和标本的交叉污染防止造成错误结果。 6. 在储存和温育时避免强光直接照射。 7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。 任何漂白成分都会破坏 8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。 试剂盒中反应试剂的生物活性。 9. 不可以使用过期产品。 10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，依规定的程序处理样品和检测装置。 保存： 贮藏于 2-8°C 。 样品： 在此检测中，可使用血清样品。 准备工作： 1. 浓缩洗涤液(100X)用双蒸水稀释成 1X （至500ml ）。 2. 标准品用 1ml 标准品稀释液复溶。得到 2000pg/ml 的高浓度标准品。高浓度标准品可保 存于-20°C 。 3. 将 2000pg/ml 的高浓度标准品稀释成一组标准品，如： 1000, 500, 250, 125, 62.5, 0pg/ml 。 4. 配制 1x HRP：一支 HRP 加入 6 ml 酶联物稀释液，混匀。1x HRP 最好在临用前 15 分 钟配制。 5. 配制 1x Biotin：一支Biotin anti mouse IL-2 加入 6 ml Biotin 稀释液，混匀。1x Biotin 最 好在临用前 15 分钟配制。 操作步骤： 试剂盒应平衡至室温（20-25°C ）再试验。 取出所需反应板。 临用前 15 分钟配制工作液 1. 加入 100ul 标准品(Standards)、100ul 血清于相应反应板孔中。 2. 轻轻混匀 30 秒，封住板孔，37°C 温育 60 分钟。 3. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入 350ul 洗涤液），并去除水滴 （在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5 次。 4. 每孔加入 100ul 1x Biotin。轻轻混匀30 秒，封住板孔，37°C 温育 60 分钟 5. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入 350ul 洗涤液），并去除水滴 （在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5 次。 6. 每孔加入 100ul 1x HRP。轻轻混匀30 秒，封住板孔，37°C 温育 30 分钟 7. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入 350ul 洗涤液），并去除水滴 （在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5 次。 8. 每孔加入 100ul TMB 显色液， 轻轻混匀 10 秒，37°C 暗处温育 15±10 分钟。 9. 每孔加入 100ul 终止液（Stop Solution)。轻轻混匀 30 秒；30 分钟内在 450nm 处读 OD 值。 以OD 值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据血清样品的OD 值可在标 准曲线上查出其浓度。 举例： 1.2 1 ) m 0.8 n 0 5 0.6 4 ( D 0.4 O 0.2 0 0 500 1000 1500 Conc. of mouse IL-2(pg/ml) 注意事项： 1. 作标准曲线时，要扣除标准品稀释液造成的本底；如果标本用标准品稀释液稀释，也要 扣除标准品稀释液造成的本底，如果标本未用标准品稀释液稀释，标本不需扣除标准品 稀释液造成的本底。 2. 生物素(Biotin anti mouse IL-2) 和浓缩酶联物(HRP)用前应离心，使液于管底。 小鼠 IL-3 ELISA 用途： 1981年Ihle等发现ConA刺激小鼠脾细胞的培养上清中含有一种因子，能提高裸鼠脾脏淋 巴细胞成熟淋巴细胞标志20-α-羟固醇脱氢酶(20-α-hydroxysteriod dehydrogenase,20αSDH)的阳性率，命名为白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)。 由于IL-3 可刺激多能干细胞和多种祖细胞的增殖与分化，又称为多重集落刺激因子(multi-colony stimulating factor,multi-CSF)。 1. IL-3的产生 主要由活化T细胞或T细胞克隆产生。小鼠髓样单核细系 (myelomonocytic cell line), WEHI-3B 细胞系可自发产生一定水平的IL-3。此外，胸腺 上皮细胞、活化小鼠肥大细胞等也可表达IL-3。 2. IL-3的分子结构和基因 1984年美国和澳大利亚分别从ConA刺激小鼠T细胞和 WEHI-3B 细胞中提取高活性部分mRNA,逆转录成cDNA，进行克隆化和DNA序列分析。编码小 鼠IL-3和GM-CSF的基因都定位于第11号染色体。IL-3的基因组由5个外显子和4个内含 子组成。cDNA编码166氨基酸残基， N端26氨基酸残基为信号肽，此外N端另有数个氨基 酸残基可能被血清蛋白酶所切除。成熟小鼠IL-3由131氨基酸残基组成，含有糖基，分子 量为25～28kDa。 1986年美籍华人杨育中从长臂猿T白血病细胞株MLA144中提取IL-3mRNA,成功地获得 长臂猿 IL-3cDNA (gIL-3cDNA), 后又用gIL-3cDNA作为探针筛选人IL-3基因组DNA，并克 隆成功。人IL-3基因结构与小鼠相似,由5个外显子和4个内含子组成，人与鼠IL-3DNA 约有45％同源性,氨基酸有29％同源性，但人鼠间IL-3生物学作用无交叉反应。人和长臂 猿IL-3有高度同源性，成熟的IL-3分子都由133个氨基酸残基组成，仅11个氨基酸残基 不同，在第16位和84位上2个半胱氨酸残基在分子内形成二硫键，除此以外还有2个N糖基化 点。在体外糖基不影响IL-3的生物学活性。hIL-3启动基因上游调控区含有多个转录调控 子同源位点，其中AP-1(TGAGTCA)位于?01处,CREB(TTACGTCT)位于-147处， NFAT-1(GATGAATAAT)位于?56处，CK-1(GAAGGTTCCA)位于?26处，CK-2(TCAGATAA)位于-115 处。hIL-3转录调控主要受上游两个顺式调控区的调控。第一个位于-121到-161之间，它 对于hIL-3转录激活最重要,其间除含有CREB、NFAT-1外，新发现了对hIL-3表达起决定 作用的转录调控蛋白结合位点，该位点被命名为NF-IL-3-A(ATGAATAA)。第二个调控区位于 -301处的AP-1位点， AP-1位点能强有力地增强hIL-3基因的转录。此外，最近还发现了 hIL-3转录抑制调控区，位于-250到-271之间，称为NIP位点。目前认为位于其上游-301 处 AP-1对hIL-3的转录增强作用是通过消除NIP对hIL-3基因转录的抑制来实现的。 人IL-3以及IL-4、IL-5、IL-13、GM-CSF、M-CSF、M-CSF受体 (c-fms编码产物)、PDGFR(血 小板衍生的生长因子受体)、β -肾上腺素能受体(β AR)、内皮细胞生长因子(ECGF)和CD14 2 2 的基因都定位于第5号染色体。这种在一定区域内连锁的现象可能与协同调节造血过程有 关，并可能与骨髓发育异常综合征(myelodysplastic syndrome, MDS)、 原发性急性非淋巴 细胞白血病 (acute nonlymphocytic leukemia, ANLL)、顽固性巨幼红细胞贫血等疾病的发 病有关。 3. IL-3的生物学活性 IL-3与其它集落刺激因子的生物学作用见表4-4。除具有多重集 落刺激作用外,最近发现 IL-3可刺激皮肤上皮细胞、CD4-CD8-TCRαβ细胞、肥大细胞、嗜 碱性粒细胞的增殖，阻止肥大细胞发生程序性细胞死亡。 本试剂盒用于定量检测小鼠血清中的 IL-3 的浓度。 原理： 本试剂盒采用双抗夹心 ELISA 法。抗小鼠 IL-3 单抗包被于酶标板上，小鼠标本中的 IL-3 会与单抗结合。加入生物素化的抗小鼠IL-3（二抗），它将与结合在单抗上的小鼠IL-3结 合而形成免疫复合物，未结合的将被洗去。辣根过氧化物酶标记的 Streptavidin 将与二抗的 生物素结合，多余的物质会被洗掉。加入 TMB 显色。小鼠 IL-3 的浓度与 OD(450nm)成正 比。 试剂盒组成： 酶标板(Coated Wells) 48wells Anti-mouse IL-3 Biotin 1 vial 浓缩洗涤液(100X)(Washing Concentrate) 5ml 标准品(Standards) 1 vial 显色液(TMB Substrate) 6ml 标准品稀释液(Standard Diluent) 7ml 终止液(Stop Solution) 6ml 浓缩酶联物（HRP ） 1 vial 酶联物稀释液(HRP Diluent) 7ml 生物素稀释液(Biotin Diluent) 7ml 需要但未提供的材料 1. 可在 450nm 处进行读数的酶标仪； 2. 能精确吸取 10-200µL 的移液器； 3. 可调多道（8 ）移液器（50－200µL ）； 4. 供可调多道移液器使用的试剂存放槽； 5. 洗瓶或洗板机； 6. 蒸馏水或去离子水； 7. 1 升的圆柱形量筒； 8. 血清移液器：1 和（10 或 25 mL ）； 9. 移液器枪头； 10. 纸巾； 11. 计时器，用以监控温育步骤； 12. 处理池和消毒剂（例如：0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水）； 需要注意的几点: 1. 严格依规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温 20-25 ℃。使用后立即冷藏保存试剂。 2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入 HRP 或底物前确保尽量吸干孔内液体。温 育过程中不要让微孔干燥掉。 3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。 4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不可以使用。 5. 避免试剂和标本的交叉污染防止造成错误结果。 6. 在储存和温育时避免强光直接照射。 7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。 8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏 试剂盒中反应试剂的生物活性。 9. 不可以使用过期产品。 10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，依规定的程序处理样品和检测装置。 保存： 贮藏于 2-8°C 。 样品： 在此检测中，可使用血清样品。 准备工作： 1. 浓缩洗涤液(100X)用双蒸水稀释成 1X （至500ml ）。 2. 标准品用 1ml 标准品稀释液复溶。得到 2000pg/ml 的高浓度标准品。高浓度标准品可保 存于-20°C 。 3. 将 2000pg/ml 的高浓度标准品稀释成一组标准品，如： 1000, 500, 250, 125, 62.5, 0pg/ml 。 4. 配制 1x HRP：一支 HRP 加入 6 ml 酶联物稀释液，混匀。1x HRP 最好在临用前 15 分 钟配制。 5. 配制 1x Biotin：一支Biotin anti mouse IL-3 加入 6 ml Biotin 稀释液，混匀。1x Biotin 最 好在临用前 15 分钟配制。 操作步骤： 试剂盒应平衡至室温（20-25°C ）再试验。 取出所需反应板。 临用前 15 分钟配制工作液 1. 加入 100ul 标准品(Standards)、100ul 血清于相应反应板孔中。 2. 轻轻混匀 30 秒，封住板孔，37°C 温育 60 分钟。 3. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入 350ul 洗涤液），并去除水滴 （在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5 次。 4. 每孔加入 100ul 1x Biotin。轻轻混匀30 秒，封住板孔，37°C 温育 60 分钟 5. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入 350ul 洗涤液），并去除水滴 （在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5 次。 6. 每孔加入 100ul 1x HRP。轻轻混匀30 秒，封住板孔，37°C 温育 30 分钟 7. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入 350ul 洗涤液），并去除水滴 （在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5 次。 8. 每孔加入 100ul TMB 显色液， 轻轻混匀 10 秒，37°C 暗处温育 15±10 分钟。 9. 每孔加入 100ul 终止液（Stop Solution)。轻轻混匀 30 秒；30 分钟内在 450nm 处读 OD 值。 以OD 值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据血清样品的OD 值可在标 准曲线上查出其浓度。 举例： 1.2 1 ) m 0.8 n 0 5 0.6 4 ( D 0.4 O 0.2 0 0 500 1000 1500 Conc. of mouse IL-3(pg/ml) 注意事项： 1. 作标准曲线时，要扣除标准品稀释液造成的本底；如果标本用标准品稀释液稀释，也要 扣除标准品稀释液造成的本底，如果标本未用标准品稀释液稀释，标本不需扣除标准品 稀释液造成的本底。 2. 生物素(Biotin anti mouse IL-3) 和浓缩酶联物(HRP)用前应离心，使液于管底。 小鼠 IL-4 ELISA 用途： 1982年Howard发现T细胞培养上清中有一种促进B细胞增殖的因子， 起初命名为B细 胞生长因子-1 (B cell growth factor-1, BCGF-1)。有的实验室称为B细胞刺激因子-1 (B cell stimulating factor-1, BSF-1)、T细胞生长因子-2 (T cell growth factor-2, TCGF-2)。1986年基因克隆成功，国际统一命名为白细胞介素4(interleukin 4, IL-4)。 1. IL-4的产生 在人类IL-4主要由活化T细胞产生。在小鼠由Th2亚群产生。此 外，肥大细胞、IL-2刺激小鼠T细胞系2.19、ConA刺激人Th克隆2F1、 小鼠胸腺瘤EL-4 细胞以及B细胞系CH12均能分泌IL-4。 2. IL-4的分子结构和基因 小鼠IL-4基因长约6kb，成熟IL-4分子由120氨基酸残 基组成，裸肽分子量为14kDa，有3个糖基化点，经糖基化后IL-4分子量为30kDa。 人IL-4 基因定位于第5号染色体，由4个外显子和3个内含子组成，约10kb， 是现知淋巴因子基 因中较大的一个。成熟人IL-4分子由129氨基酸残基组成，15kDa，有2个糖基化点，含有 6个半胱氨酸，参与分子内二硫键的组成。人与鼠IL-4 DNA水平上有70％同源性， IL-4 前体蛋白从N 端到91位氨基酸以及C 端到128位氨基酸人小鼠之间在氨基酸水平上有70 ％同源性，前体蛋白91至128位氨基酸之间很少有同源性，这可能与IL-4种属作用特异性 有关，如人、 鼠IL-4生物学作用上没有交叉反应。 3. IL-4的受体 IL-4受体(IL-4R)由802氨基酸残基组成,分子量为140kDa,胞膜外 区 209氨基酸，跨膜区24氨基酸，胞浆区569氨基酸，与小鼠IL-4R有53％同源性，属于 红细胞生成素受体超家族成员,最近命名为CDw124。在小鼠,T细胞、B细胞、胸腺细胞、骨髓 细胞、巨噬细胞和肥大细胞表面都有IL-4R，每个细胞受体数目在100～2000左右，其亲和 -10 -11 -12 3 力Kd在10 ～10 M, 1～5×10 M浓度的IL-4可使B细胞增殖( H-TdR掺入率)达到最大值的 50％。LPS 对B细胞IL-4R表达有正调节作用，受体数量可增加5～10倍。IL-4与相应受体 结合后细胞内传递信号的途径尚不清楚，IL-4R胞浆区富含脯氨酸和丝氨酸, PTK 和PKC可能 参与受体介导的信号传递，IP3和Ca２＋ 浓度升高。 在小鼠已发现有不同剪接形式 mRNA所翻译的分泌型(可溶性)IL-4R(sIL-4R)。sIL-4R与膜型IL-4R(mIL-4R)同配体IL-4结 合时具有相同的亲和力。sIL-4R可能是IL-4保护性载体，或调节IL-4的生物学活性。 4. IL-4的生物学活性 IL-4对于B细胞、T细胞、肥大细胞、巨噬细胞和造细胞都有 免疫调节作用。 (1) B细胞: 促进SAC或抗IgM预先刺激B细胞的增殖，这一生物学功能已被用来作为 检测 IL-4的生物学活性。IL-4促进B细胞MHCⅡ类抗原、FcεRⅡ/CD23和CD40的表达， 并增强B细胞提呈抗原能力,使免疫系统对小量抗原刺激发生免疫应答。增加 FcεRⅡ/CD23(IgE Fc 段低亲和力受体) 的表达，并释放可溶性CD23(sCD23)/IgE结合因子 (IgE-BF),与mIgE阳性细胞结合并诱导其分化，可能与促进Ｂ细胞IgE的产生有关。IL-4 提高LPS刺激小鼠B细胞 IgG1、IgE产生水平分别为8～10倍和10～100倍,但对IgG3分 泌降低6～10倍，IgG2a、IgG2b和IgM有不同程度下降，对IgA产生无明显影响。IL-4增 强IgG1和IgE水平的机理可能是: ①使选择性刺激定向产生IgG1或IgE的B细胞的增殖和 分化；②增加特异的重链稳定区(CＨ)Ig 类的转换使Sμ-Sγ1结合，促进IgG1合成和分 泌。IFN-γ对IL-4上述生物学功能有明显抑制作用。而IL-4则可抑制IFN-γ mRNA的转 录和抑制IFN-γ诱导B细胞产生IgG2a。寄生虫感染时血清IgG1和IgE水平升高。此外， IL-4还可促进休止期B细胞的早期活化，从Go期进入G1期，细胞体积增大，并表达 CD25。 (2)T细胞: IL-4是T细胞自身分泌的生长因子，如HT-2细胞系是一种IL-2依赖细胞 系，IL-4可单独维持TH-2的增殖，抗IL-2和抗IL-4 McAb(11B11)可分别抑制IL-2和IL-4 刺激TH-2细胞的增殖作用，但相互之间无交叉抑制作用。纯化后的T细胞(CD4阳性或CD8 阳性亚群) 对IL-4的增殖反应还需要IL-1(或PMA)的协同作用；而IL-2单独可维持活化T 细胞的增殖。表明IL-4生长信号的传递过程与IL-2不一样。高剂量IL-4能诱导CD4-CD8+ 或CD4+CD8-或CD4-CD8-胸腺细胞的增殖。IL-4 增强PHA刺激T细胞释放GM-CSF和G-CSF。 在小鼠实验系统中，多数情况下IL-4对CTL和LAK细胞的分化有正调节作用；而对人的杀 伤细胞则有时表现为负调节作用，如在人MLC中IL-4选择性地促进Th增殖,同时伴有CTL、 NK和LAK功能的降低。此外IL-4还能抑制IL-2所诱导的NK白血病细胞LAK活性。最近发 现,用IL-4与T细胞或B细胞温育，可降低高亲和力IL-2R位点数,但不影响低亲和力IL-2R 的数量。IL-4还可刺激CD3阴性NK细胞克隆的生长。 (3)刺激肥大细胞增殖，并与IL-3有协同作用， 尤其对于粘膜和结缔组织型肥大细胞 体外生长是必需的。 (4)促进巨噬细胞提呈抗原和杀伤肿瘤细胞的功能,可能与调节MHCⅡ类抗原和FcR表达 有关。IL-4 与GM-CSF、IL-3和LPS有协同作用。IL-4可诱导外周血单核细胞分泌G-CSF 和M-CSF,增强中性粒细胞介导的吞噬、杀伤活性和ADCC作用。IL-4是小鼠巨噬细胞趋化因 子，并促进IL-1ra产生，但抑制单核细胞IL-1、TNF和IL-6的产生。 (5)协同 CSF刺激造血细胞的增殖，与G-CSF协同增强粒细胞集落形成，协同红细胞生 成素(EPO)增强 BFU-E的形成。 本试剂盒用于定量检测小鼠血清、细胞培养液、组织匀浆中的 IL-4 的浓度。 原理： 本试剂盒采用双抗夹心 ELISA 法。抗小鼠 IL-4 单抗包被于酶标板上，小鼠标本中的 IL-4 会与单抗结合。加入生物素化的抗小鼠IL-4（二抗），它将与结合在单抗上的小鼠IL-4结 合而形成免疫复合物，未结合的将被洗去。辣根过氧化物酶标记的 Streptavidin 将与二抗的 生物素结合，多余的物质会被洗掉。加入 TMB 显色。小鼠 IL-4 的浓度与 OD(450nm)成正 比。 试剂盒组成： 酶标板(Coated Wells) 48wells Anti-mouse IL-4 Biotin 1 vial 浓缩洗涤液(100X)(Washing Concentrate) 5ml 标准品(Standards) 1 vial 显色液(TMB Substrate) 6ml 标准品稀释液(Standard Diluent) 7ml 终止液(Stop Solution) 5ml 浓缩酶联物（HRP ） 1 vial 酶联物稀释液(HRP Diluent) 7ml 生物素稀释液(Biotin anti IL-4 Diluent) 7ml 需要但未提供的材料 1. 可在 450nm 处进行读数的酶标仪； 2. 能精确吸取 10-200µL 的移液器； 3. 可调多道（8 ）移液器（50－200µL ）； 4. 供可调多道移液器使用的试剂存放槽； 5. 洗瓶或洗板机； 6. 蒸馏水或去离子水； 7. 1 升的圆柱形量筒； 8. 移液器：1 和（10 或 25 mL ）； 9. 移液器枪头； 10. 纸巾； 11. 计时器，用以监控温育步骤； 12. 处理池和消毒剂（例如：0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水）； 需要注意的几点: 1. 严格依规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温 20-25 ℃。使用后立即冷藏保存试剂。 2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入 HRP 或底物前确保尽量吸干孔内液体。温 育过程中不要让微孔干燥掉。 3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。 4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不可以使用。 5. 避免试剂和标本的交叉污染防止造成错误结果。 6. 在储存和温育时避免强光直接照射。 7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。 8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏 试剂盒中反应试剂的生物活性。 9. 不可以使用过期产品。 10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，依规定的程序处理样品和检测装置。 保存： 贮藏于 2-8°C 。 样品： 在此检测中，可使用血清、细胞培养液、组织匀浆样品。 准备工作： 1. 浓缩洗涤液(100X)用双蒸水稀释成 1X （至500ml ）。 2. 标准品用 1ml 标准品稀释液复溶。得到 1000pg/ml 的高浓度标准品。高浓度标准品可保 存于-20°C 。 3. 将 1000pg/ml 的高浓度标准品稀释成一组标准品，如： 500, 250, 125, 62,5,31.25, 0pg/ml 。 4. 配制 1x HRP：一支 HRP 加入 6 ml 酶联物稀释液，混匀。1x HRP 最好在临用前 15 分 钟配制。 5. 配制 1x Biotin：一支Biotin anti mouse IL-4 加入 6 ml Biotin 稀释液，混匀。1x Biotin 最 好在临用前 15 分钟配制。 操作步骤： 试剂盒应平衡至室温（20-25°C ）再试验。 取出所需反应板。 临用前 15 分钟配制工作液 1. 加入 100ul 标准品(Standards)、100ul 标本于相应反应板孔中。 2. 轻轻混匀 30 秒，封住板孔，37°C 温育 60 分钟。 3. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入 350ul 洗涤液），并去除水滴 （在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5 次。 4. 每孔加入 100ul 1x Biotin。轻轻混匀30 秒，封住板孔，37°C 温育 60 分钟 5. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入 350ul 洗涤液），并去除水滴 （在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5 次。 6. 每孔加入 100ul 1x HRP。轻轻混匀30 秒，封住板孔，37°C 温育 30 分钟 7. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入 350ul 洗涤液），并去除水滴 （在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5 次。 8. 每孔加入 100ul TMB 显色液， 轻轻混匀 10 秒，37°C 暗处温育 15±10 分钟。 9. 每孔加入 100ul 终止液（Stop Solution)。轻轻混匀 30 秒；30 分钟内在 450nm 处读 OD 值。 以OD 值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD 值可在标准曲 线上查出其浓度。 举例： 1.2 1 ) m 0.8 n 0 5 0.6 4 ( D 0.4 O 0.2 0 0 200 400 600 Conc. of mouse IL-4(pg/ml) 需要注意的几点： 1. 作标准曲线时，要扣除标准品稀释液造成的本底；如果标本用标准品稀释液稀释，也要 扣除标准品稀释液造成的本底，如果标本未用标准品稀释液稀释，标本不需扣除标准品 稀释液造成的本底。 2. 生物素(Biotin anti mouse IL-4) 和浓缩酶联物(HRP)用前应离心，使液于管底。 小鼠 IL-8 ELISA 用途： 1986年Kownatzki等首先证实了单核细胞可产生一种中性粒细胞趋化因子。嗣后， 不同实 验室根据这种因子不同的生物学活性有不同的命名，如中性粒细胞激活蛋白 -1(neutrophil-activating protein-1, NAP-1)，单核细胞来源的中性粒细胞趋化因子 (monocyte-derived neutrophil chemotactic factor, MDNCF), 单核细胞来源的中性粒细 胞激活肽(monocyte-derived neutrophil-activating peptide, MDNAP)，中性粒细胞激活 因子(neutrophil-ac-tivating factor, NAF)，中性粒细胞激活肽(neutrophil-activating peptide, NAP)，T淋巴细胞趋化因子(T lymphocyte chemotactic factor, TCF)和内皮细 胞来源的中性粒细胞激活肽(endothelial-derived nentrophil-activating peptide, EDNAP)。1988年基因克隆成功，属于C-X-C亚族(α亚族)成员，目前文献中多采用名称是 IL-8(interleukin-8)/NAP-1。 1. IL-8的产生 (1)IL-1、TNF、LPS和PMA均能诱导单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞和表皮细 胞等合成和分泌 IL-8。 (2)PHA等丝裂原活化的T细胞也可产生IL-8。 (3)人类多种肿瘤细胞均可高表达IL-8。其中甲状腺癌、鳞状细胞癌、 黑素瘤等可组成性 产生 IL-8，而星状细胞瘤、肝癌、肾细胞癌等则需在IL-1β或TNF-α等刺激下才合成和 分泌IL-8。 2. IL-8的分子结构 IL-8分子量8.3kDa，不成熟的IL-8为99个氨基酸，单核细胞产生 的成熟 IL-8分子主要形式为72个氨基酸，而内皮细胞产生的成熟IL-8分子主要为77个氨 基酸。在α亚族中，IL-8与GROα、GROβ、GROγ、ENA-78和NAP-2相对有较高源性。 IL-8 分子含4个Cys，无N糖基化位点，IP8.0～8.5，耐热、耐碱，但对巯基化合物敏感。1988 年Matsushima首次获得IL-8 cDNA克隆，并在大肠杆菌和中国仓鼠卵母细胞中表达成功。 人IL-8基因定位于第4号染色体，基因组有4个外显子和3个内含子。5端上游有典型的 “CAT”和“TATA”盒以及AP-1结合序列和糖皮质反应元件(GRE)等结构。IL-8基因与CXC 亚族中PF-4、GROα、 γIP-10基因相连。成熟的IL-8分子可有6种不同形式，分别由69、 70、71、72、77和79个氨基酸组成，其差异在IL-8分子的N端，是由蛋白酶水解的不同 所致。在体外， 凝血酶或血纤维蛋白溶酶可将77氨基酸形式裂解为72氨基酸形式的IL-8， 后者较前者的生物学活性要高2～10倍。 3. IL-8受体 IL-8受体有两型:IL-8R A型(或IL-8RⅠ)和IL-8R B型(或IL-8RⅡ)，两型受 体在氨基酸水平上有 77％同源性，最近命名为CDw128。IL-8R A特异性结合IL-8， 为高亲 和力，受体主要分布于中性粒细胞(每个细胞20000受体，Kd为8×10-10M)、单核细胞、 T 细胞和黑素瘤细胞。IL-8R B除与IL-8结合外，还可结合GROα、GROβ、GROγ和NAP-2，与 IL-8、GROα、GROβ和GROγ结合为高亲和力。与IL-8R B结合的这5种配体分子近N端均具 有一个Glu-Leu-Arg(ELR)序列，可能是与IL-8R B结合的一个重要结构。此型受体主要分布 于中性粒细胞和髓样细胞前体细胞系，如HL60细胞系。IL-8R属于G蛋白偶联受体，与fMLP 受体和C5a受体有29％～34％同源性。IL-8与相应受体结合后可使细胞内Ca２＋浓度 短暂升高,百日咳杆菌毒素(IAP)可抑制IL-8的这种刺激作用， 表明IAP敏感的G蛋白与IL-8 受体的信号转导有关。此外，细胞膜磷酸肌醇脂代谢和PKC也与IL-8R的信号转导有关。最近 证实人红细胞膜表面Duffy抗原(gpD)可结合包括IL-8在内的多种趋化因子，这种受体还分 布在肾脏和大脑，可能具有清除循环中IL-8等趋化因子的功能，在炎症发生过程中具有重 要的调节作用。 4. IL-8的生物学活性 (1)趋化和激活中性粒细胞:IL-8的这种效应无明显种属特异性。动物腹腔或静脉注射IL-8 可引起外周血中性粒细胞数量的增加。IL-8可使中性粒细胞外形改变，促进其脱颗粒，激 - 活中性粒细胞并使其产生呼吸爆发(respiratory burst)、释放超氧化物(O 、H O )和溶酶体 2 2 2 酶。局部注射IL-8可趋化中性粒细胞，并刺激中性粒细胞产生白三烯B4(LTB4)而使皮下血 浆渗出，IL-8还能诱导中性粒细胞上调Macl抗原(CD11b/CD18)的表达，促进中性粒细胞粘 附到内皮细胞和内皮细胞下的基质蛋白。 (2)趋化嗜碱性粒细胞，并刺激其释放组织胺，可能与速发型超敏反应的发生有关。 此外， 还可刺激 GM-CSF或IL-5预先处理的嗜酸性粒细胞的脱颗粒作用。 (3)趋化T淋巴细胞:可趋化部分静止的CD4+或CD8+T细胞，这种趋化作用需要单核细胞的 同时存在。局部注射 IL-8可使局部和引流区淋巴结T细胞明显增多。 IL-8还可明显趋化 IL-2活化的NK细胞。 (4)IL-8是角化细胞的复合促有丝分裂原(co-mitogen)， 也是黑素瘤细胞的自分泌生长因 子。 本试剂盒用于定量检测小鼠血清中的 IL-8 的浓度。 原理： 本试剂盒采用双抗夹心 ELISA 法。小鼠血清中的 IL-8 与生物素化的抗小鼠 IL-8 单抗结合， 并且生物素化的抗小鼠 IL-8 单抗上的生物素与酶标板上 Streptavidin 结合； 加入辣根过氧 化物酶标记的抗小鼠 IL-8，它将与小鼠IL-8 结合而形成免疫复合物。加入 TMB 显色。小鼠 IL-8 的浓度与OD(450nm)成正比。 试剂盒组成： 酶标板(Coated Wells) 96wells Anti-mouse IL-8 Biotin 6ml 浓缩洗涤液(20X)(Washing Concente) 25ml 标准品(Standards) 1 set 显色液 10ml Anti mouse IL-8 POD 6ml 终止液(Stop Solution) 10ml 需要但未提供的材料 1. 可在 450nm 处进行读数的酶标仪； 2. 能精确吸取 10-200µL 的移液器； 3. 可调多道（8 ）移液器（50－200µL ）； 4. 供可调多道移液器使用的试剂存放槽； 5. 洗瓶或洗板机； 6. 蒸馏水或去离子水； 7. 1 升的圆柱形量筒； 8. 血清移液器：1 和（10 或 25 mL ）； 9. 移液器枪头； 10. 纸巾； 11. 计时器，用以监控温育步骤； 12. 处理池和消毒剂（例如：0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水）； 注意事项: 所有试剂都必须在使用前达到室 1. 严格依规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。 温 20-25 ℃。使用后立即冷藏保存试剂。 2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中 不要让微孔干燥掉。 3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。 4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不可以使用。 5. 避免试剂和标本的交叉污染防止造成错误结果。 6. 在储存和温育时避免强光直接照射。 7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。 8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏 试剂盒中反应试剂的生物活性。 9. 不可以使用过期产品。 10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，依规定的程序处理样品和检测装置。 保存： 贮藏于 2-8°C 。 标本 1. 本试剂盒可采用血清标本。 2. 室温 （20 －25 ℃）下保存标本别超过 8 小时。2 －10℃保存血清，不超过48 小时。如 耽搁的时间更长，请在-20℃或更低的温度下保存标本。标本避免多次冻融，这样可能 会损失蛋白活性，产生错误结果。 准备工作： 1. 浓缩洗涤液(20X)用双蒸水稀释成 1X(至 500ml) 。 操作步骤： 试剂盒应平衡至室温（20-25°C ）再试验。 取出所需反应板。 1. 加入 10ul 标准品(Standards)、10ul 血清于相应反应板孔中。 2. 每孔加入 40ul Anti mouse IL-8 Biotin 和 40ul Anti mouse IL-8 POD 。轻轻混匀30 秒，封 住板孔，室温温育 45 分钟。 3. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入 350ul 洗涤液），并去除水滴 （在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5 次。 4. 每孔加入 100ul 显色液， 轻轻混匀 10 秒，室温温育 20 分钟。 5. 每孔加入 100ul 终止液（Stop Solution）。轻轻混匀30 秒；30 分钟内在 450nm 处读 OD 值。 以OD 值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据血清样品的OD 值可在标 准曲线上查出其浓度。 举例： 3.5 ) m 3 n 0 5 2.5 4 ( 2 e c n 1.5 a b r 1 o s 0.5 b A 0 0 200 400 600 800 Conc. of mouse IL-8(pg/ml) 小鼠 IL-12 ELISA 适用于小鼠血清标本 用途： 1982年Wagner等发现在丝裂原刺激小鼠淋巴细胞的条件培养液中存在一种不同于IL-2 的细胞因子,这种细胞因子在体外能与 IL-2协同促进鼠CTL应答。1986年在人混合淋巴细 胞培养(MLC)或PHA活化的PBMC培养上清中也发现了与此类似的因子，称为CTL成熟因子 (cytotoxic lymphocyte maturation factor, CLMF; 或Tc maturation factor TcMF)。1991 年Gubler等将 CLMF cDNA 克隆并表达成功，表明是一种新的细胞因子，遂将 CLMF命名为 白细胞介素12(interleukin 12, IL-12)。 1. IL-12的产生 主要由B淋巴细胞产生。 (1)MLC或丝裂原活化的PBMC培养上清。 (2)PMA与钙离子载体A23187联合刺激EBV转化的B淋巴样母细胞RPMI8866可产生较 高水平的 IL-12。 2. IL-12的分子结构和基因 IL-12是由二硫键联接的异源双体，两个亚单位的分子 量分别为 35kDa和40kDa,等电点在pH4.5～5.5。从高产IL-12的人B淋巴样母细胞亚克隆 NC37.98基因文库中克隆了IL-12 cDNA,转染COS细胞获得高表达。人IL-12 P35亚单位有 197个氨基酸残基,含7个半胱氨酸和3个N 糖基化位点，P40亚单位306个氨基酸残基，有 10个半胱氨酸,4个N-糖基化位点。小鼠IL-12P35有193个氨基酸残基，与人IL-12 P35 有66％同源性，P40有313个氨基酸残基与人P40有70％同源性。 在生理情况下，亚单位 中的半胱氨酸残基之间可能形成复杂的分子间二硫键结构。两个亚单位是由不同的基因所编 码，基因转染试验根据结果得出，只有将编码两个亚单位cDNA同时转染才可以获得有生物学活性 的IL-12。 P35与IL-6和G-CSF有同源性，P40与IL-6受体、睫状神经营养因子(CNTF)受 体、G-CSF受体有同源性，具有细胞因子受体家族的特征。提示 IL-12分子可能是一种细胞 因子/可溶性细胞因子受体复合物。在RPMI8866细胞系中纯化到的自然杀伤细胞刺激因子 (natural killer cell stimulating factor, NKSF)的结构和功能与IL-12相同。 3. IL-12受体 IL-12R亚单位的基因最近克隆成功，推算有662个氨基酸，裸肽分 子量 70kDa，糖基化后约为100kDa。IL-12R亚单位为Ⅰ型穿膜蛋白，胞膜外区含516个氨 基酸残基，与gp130、G-CSFR、LIFR高度同源。单体IL-12R不结合IL-12，双体或寡聚体 IL-12R亚单位与IL-12(p40亚单位为与受体结合部位)结合为低亲和力，Kd2～6nM。 PBMC 表面有IL-12高亲和力受体，Kd约100pM，目前与IL-12R亚单位组成高亲和力的另一个亚 单位尚未确定。IL-12 P35亚单位、P40亚单位和IL-12R亚单位分别与IL-6、IL-6R和gp130 有很高的同源性，而且相互结合的模式也十分相似， 即IL-12P35同P40形成异源双体后可 同双体或寡聚体的IL-12R亚单位结合，而IL-6同IL-6R受体结合后可同gp130二聚体结合。 IL-12受体分布于PHA活化的CD4+、CD8+T细胞亚群以及IL-2活化的CD56+NK细胞，1000～ 9000IL-12结合点/细胞。 4. IL-12的生物学功能 人IL-12作用有种属特异性，人IL-12对小鼠细胞作用甚微。 (1)与IL-2协同诱导CTL的分化，促进同种异体CTL反应。 (2)刺激PHA活化CD3+T细胞(包括CD4+和CD8+) 增殖。IL-12诱导T细胞最大增殖水 平低于 IL-2的增殖刺激作用，但刺激50％最大增殖所需细胞因子浓度远低于IL-2。 IL-12 这种增殖作用所经途径与IL-2、IL-4 和IL-7的刺激作用不同，因为针对IL-2、IL-2R、 IL-4 和IL-7的单克隆抗体不能阻断IL-12的增殖作用；IL-12单克隆抗体对IL-2、IL-4和IL-7 诱导增殖亦无阻断作用。IL-12对静止PBMC不具有增殖作用，这一性质与IL-4相似。但IL-12 与亚适剂量IL-2可协同诱导静止PBMC增殖。其机理可能是:①IL-12促进IL-2诱导T细胞 IL-2R P55的表达，提高PBMC对IL-2的反应性；②IL-2促进PBMC某些亚群IL-12R表达； ③在IL-2存在的条件下，IL-12可提高IFN-γ mRNA 转录水平，增加其稳定性，促进分泌 IFN-γ，如小鼠IL-12可诱导Th1细胞产生 IFN-γ。此外，IL-12通过诱导产生的IFN-γ 激活巨噬细胞，诱导其TNF-α的分泌。IL-12可诱导Th1亚群的形成，此作用可能通过两 种途径: ①IL-12直接作用于Th1亚群；②IL-12刺激T细胞、NK细胞产生IFN-γ诱导Th1 亚群形成。 (3)协同IL-2 诱导CD56+NK细胞增殖以及LAK细胞产生，促进ADCC功能，NKSF释放， 诱导 CD56、CD2、CD11a、IL-2R、TNFR(CD120b)、LFA-1和ICAM-1等分子的表达。 (4)促进B细胞I生和Ig类型转换，由IgM转为IgG，抑制IL-4诱导B细胞IgE合 成。这种抑制作用是T细胞依赖的，其作用机理与IFN-γ、TGF-β和IL-8抑制IgE产生的 机理可能不一样。 本试剂盒用于定量检测小鼠血清中的 IL-12 的浓度。 原理： 本试剂盒采用双抗夹心ELISA 法。 小鼠血清中的IL-12 与生物素化的抗小鼠IL-12 单抗结合， 并且生物素化的抗小鼠 IL-12 单抗上的生物素与酶标板上 Streptavidin 结合； 加入辣根过氧 化物酶标记的抗小鼠 IL-12 ，它将与小鼠IL-12 结合而形成免疫复合物。加入 TMB 显色。小 鼠IL-12 的浓度与OD(450nm)成正比。 试剂盒组成： 酶标板(Coated Wells) 48wells Anti-mouse IL-12 Biotin 3ml 浓缩洗涤液(20X)(Washing Concente) 25ml 标准品(Standards) 1 set 显色液 5ml Anti mouse IL-12 POD 3ml 终止液(Stop Solution) 5ml 需要但未提供的材料 1. 可在 450nm 处进行读数的酶标仪； 2. 能精确吸取 10-200µL 的移液器； 3. 可调多道（8 ）移液器（50－200µL ）； 4. 供可调多道移液器使用的试剂存放槽； 5. 洗瓶或洗板机； 6. 蒸馏水或去离子水； 7. 1 升的圆柱形量筒； 8. 血清移液器：1 和（10 或 25 mL ）； 9. 移液器枪头； 10. 纸巾； 11. 计时器，用以监控温育步骤； 12. 处理池和消毒剂（例如：0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水）； 需要注意的几点: 所有试剂都必须在使用前达到室 1. 严格依规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。 温 20-25 ℃。使用后立即冷藏保存试剂。 2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中 不要让微孔干燥掉。 3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。 4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不可以使用。 5. 避免试剂和标本的交叉污染防止造成错误结果。 6. 在储存和温育时避免强光直接照射。 7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。 8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏 试剂盒中反应试剂的生物活性。 9. 不可以使用过期产品。 10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，依规定的程序处理样品和检测装置。 保存： 贮藏于 2-8°C 。 标本收集 1. 新鲜血清和正确保存的血清可用在本试剂盒上。不需添加任何抗凝剂或进行预处理。避 免使用溶血标本，脂质标本或微生物污染的血清。 2. 室温 （20 －25 ℃）下保存标本别超过 8 小时。2 －10℃保存血清，不超过48 小时。如 耽搁的时间更长，请在-20℃或更低的温度下保存标本。标本避免多次冻融，这样可能 会损失抗体活性，产生错误结果。 准备工作： 1. 浓缩洗涤液(20X)用双蒸水稀释成 1X(至 500ml) 。 操作步骤： 试剂盒应平衡至室温（20-25°C ）再试验。 取出所需反应板。 1. 加入 10ul 标准品(Standards)、10ul 血清于相应反应板孔中。 2. 每孔加入 40ul Anti mouse IL-12 Biotin 和 40ul Anti mouse IL-12 POD 。轻轻混匀30 秒， 封住板孔，室温温育 45 分钟。 3. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入 350ul 洗涤液），并去除水滴 （在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5 次。 4. 每孔加入 100ul 显色液， 轻轻混匀 10 秒，室温温育 20 分钟。 5. 每孔加入 100ul 终止液（Stop Solution）。轻轻混匀30 秒；30 分钟内在 450nm 处读 OD 值。 以OD 值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据血清样品的OD 值可在标 准曲线上查出其浓度。 举例： 3.5 ) m 3 n 0 5 2.5 4 ( 2 e c n 1.5 a b r 1 o s 0.5 b A 0 0 500 1000 1500 Conc. of mouse IL-12(pg/ml) 小鼠 IFN-γ ELISA 用途： 1965年Wheelock等首先在PHA刺激的白细胞培养上清中发现具备IFN样抗病毒物质，但在 pH2 条件下即失去抗病毒的活性。1973年Younger和Salvin发现来自淋巴细胞培养上清中 存在一种IFN，但抗原性不同于以往发现的IFN，遂命名为Ⅱ型IFN，1980年统一命名为 IFN-γ。1981年Goeddle等将IFN-γ基因克隆成功。 1. IFN-γ的产生 主要由活化T细胞产生，在小鼠，由Th1亚群产生。当抗原、PHA或ConA 刺激后 T细胞分泌IFN-γ，通常与IL-2的产生相一致。目前认为巨噬细胞活化因子(MAF) 的主要活性存在于IFN-γ中。此外，活化NK细胞也可产生IFN-γ。 2. IFN的分子结构和基因 人和小鼠IFN-γ基因分别定位于12号和10号染色体，在DNA 水平上 IFN-γ基因与IFN-α/β基因无同源性。人和小鼠IFN-γ在DNA水平上有65％左 右同源性，在氨基酸水平的同源性只有40％左右。小鼠成熟IFN-γ分子由133个氨基酸残 基组成。 人IFN-γ成熟分子由143个氨基酸组成，糖蛋白，以同源双体形式存在，分子量 为40kDa，其生物学作用有严格的种属特异性。 3. IFN-γ受体 人IFN-γR基因定位于第6号染色体，小鼠在第10号染色体。IFN-γ受体 -9 -11 分布广泛， 受体阳性细胞每个细胞约表达 100～1000个受体，亲和力kD 10 ～5×10 M。 裸肽分子量50kDa，糖基化后90kDa，其N末端与IFNα/β受体有一定的同源性，具有种属特 异性。目前认为人IFN-γR有几率存在着第二条链。 IFN-γR为穿膜糖蛋白，胞膜外区、穿膜区和胞浆区分别有228、21和223个氨基酸残基， 从胞膜外区结构特征来看，属于细胞因子受体干扰素受体家族，最近命名为 CDw119。 IFN-γ配体诱导IFN-γR二聚体化在信号转导中可能起及其重要的作用， 并与受体的磷酸化有关。 IFN-γ 与受体结合后可活化多种IFN-γ调节的基因。目前已知，IFN-γ刺激后至少有20 种蛋白被表达，其中12种是IFN刺激后所特有的。这种表达是由于活化特异的DNA结合蛋 白使其从胞浆移位到胞核，如干扰素刺激的基因因子2(interferon-stimulated gene factor 2,ISGF2)和γ-干扰素激活因子(gamma-interferon activation factor,GAF或 STAT91)结合到IFN基因启动子中两个称之为γ干扰素活化点(gamma-interferon activation site, GAS) 和干扰素刺激的反应元件(interferon-stimulated response element,ISRE)的位置上。IFN-γ可促进HLA-B、HLA-DR、IP-10、P1激酶和2-5A合成酶的 合成， 其中P1激酶可能抑制病毒蛋白的翻译，而2-5A合成酶则可裂解病毒RNA。 4. IFN-γ的生物学活性 IFN-γ生物学作用有较严格的种属特异性，人IFN-γ只作用于 人或灵长类动物的细胞。 (1)诱导单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞、 星状细胞等 MHCⅡ类抗原的表达，使其参与抗原提呈和特异性免疫的识别过程。此外， IFN-γ 可上调 内皮细胞ICAM-1(CD54)表达，促进巨噬细胞FcγR表达，协同诱导TNF并促进巨噬细胞杀 伤病原微生物。 (2)促进LPS体外刺激小鼠B细胞分泌IgG2a，降低IgG1、IgG2b、IgG3和IgE的产生；抑 制由 IL-4诱导的小鼠B细胞增殖，IgG1和IgE产生以及FcεRⅡ表达； 促进SAC诱导的人 B细胞的增殖。 (3)协同IL-2诱导LAK活性，促进T细胞IL-2R表达。 (4)诱导急性期蛋白合成，诱导髓样细胞分化。 本试剂盒用于定量检测小鼠血清中的 IFN-r 的浓度。 原理： 本试剂盒采用双抗夹心 ELISA 法。抗小鼠IFN-r单抗包被于酶标板上，小鼠标本中的IFN-r 会与单抗结合。加入生物素化的抗小鼠IFN-r（二抗），它将与结合在单抗上的小鼠IFN-r 结合而形成免疫复合物，未结合的将被洗去。辣根过氧化物酶标记的 Streptavidin 将与二抗 的生物素结合，多余的物质会被洗掉。加入 TMB 显色。小鼠 IFN-r 的浓度与 OD(450nm) 成正比。 试剂盒组成： 酶标板(Coated Wells) 48wells Anti-mouse IFN-r Biotin 1 vial 浓缩洗涤液(100X)(Washing Concentrate) 5ml 标准品(Standards) 1 vial 显色液(TMB Substrate) 6ml 标准品稀释液(Standard Diluent) 7ml 终止液(Stop Solution) 6ml 浓缩酶联物（HRP ） 1 vial 酶联物稀释液(HRP Diluent) 7ml 生物素稀释液(Biotin Diluent) 7ml 需要但未提供的材料 1. 可在 450nm 处进行读数的酶标仪； 2. 能精确吸取 10-200µL 的移液器； 3. 可调多道（8 ）移液器（50－200µL ）； 4. 供可调多道移液器使用的试剂存放槽； 5. 洗瓶或洗板机； 6. 蒸馏水或去离子水； 7. 1 升的圆柱形量筒； 8. 血清移液器：1 和（10 或 25 mL ）； 9. 移液器枪头； 10. 纸巾； 11. 计时器，用以监控温育步骤； 12. 处理池和消毒剂（例如：0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水）； 需要注意的几点: 1. 严格依规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温 20-25 ℃。使用后立即冷藏保存试剂。 2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入 HRP 或底物前确保尽量吸干孔内液体。温 育过程中不要让微孔干燥掉。 3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。 4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜。