发布日期： 2023-11-30 17:54:15 来源：火狐体育全站官网app
(b)对于血清样品，将全血在室温下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000-2000g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意别吸取白色或淡黄色沉淀。制备好的血清需置于冰上待用。(c)对于血浆样品，采集的全血建议使用EDTA进行抗凝处理，混匀后置冰上，4℃约1000-2000g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意别吸取白色沉淀。制备好的血浆需置于冰上待用。(d)若待测样品不能及时检测，样品制备后请分装，冻存于-20℃或-80℃，并注意避开反复冻融。a.试剂盒从冰箱中取出后应置室温(25-28℃)平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时置于4℃保存。b.配制适当量的洗涤液：将洗涤液(20X)用双蒸水或去离子水稀释至1X，例如10ml洗涤液(20X)加190ml水混匀后即为1X的洗涤液。c.按标准品标签上标注的体积加入标准品稀释液至1瓶标准品中，室温孵育15分钟(为确保标准曲线的准确性，切勿缩短孵育时间)。随后轻轻混匀并用移液枪吹打几次使标准品彻底溶解，使标准品终浓度达到1000pg/ml。通常每个浓度的标准品需要检测2个孔，每个孔的标准品用量为100μl，共需200μl，同时稀释时还需要用250μl，因此如果1瓶标准品配制后的体积不足0.45ml，请使用更多瓶数的标准品，并在合并混匀后使用。d.取5个洁净的1.5毫升离心管，每管预先加入250μl的标准品稀释液，并参考图2进行标准品的倍比稀释，最终得到1000、500、250、125、62.5、31.25pg/ml共六个标准品浓度，最后将稀释好的标准品依次加入预包被板孔中，标准品稀释液直接加入作为0pg/ml浓度，共七个标准品浓度。
图2.标准品倍比稀释示意图。按标准品(STANDARD)标签上标注体积加入标准品稀释液溶解并混匀后的浓度为标准品的起始浓度。其它的倍比稀释后的浓度依次为起始浓度的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32。3.洗涤方法自动洗板机或手工洗板：每孔洗涤液为300μl，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣在厚吸水纸上适当用力拍干。4.实验过程需自备的材料和仪器a.不一样的规格的移液枪及相应的吸头b.酶标仪c.自动洗板机(如果没有也可以手工洗板)d.去离子水或双蒸水5.操作步骤a.计算并确定一次实验所需的预包被板条数，取出所需板条放置在96孔框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。b.每次实验都需配制标准品并绘制出标准曲线，同时建议设置本底较正孔，即空白孔，设置方法为该孔只加TMB溶液和终止液。c.分别将样品或不同浓度标准品按照100μl/孔加入相应孔中，用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育120分钟。对于血清血浆样品的ALCAM的检测，请先加入50ul的样品分析缓冲液后再加入50ul样品(注：此时样品相当于已经被稀释了2倍)。如果样品浓度过高超出检验测试范围，请先加入50ul的样品分析缓冲液，再加入50μl稀释后的样品。请注意记录好样品的稀释倍数。注意：请先查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度，如果该浓度大于或者小于本试剂盒的最高或者最低标准品浓度，请适当稀释或浓缩后再进行仔细的检测。d.洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。e.加入生物素化抗体100μl/孔(注：此生物素化抗体已经预先配制好，可以直接用，不必再进行稀释)。用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育60分钟。f.洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。g.加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin100μl/孔(注：此辣根过氧化物酶标记Streptavidin已经预先配制好，可以直接用，不必再进行稀释)。用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育20分钟。室温偏低时(低于25℃)，需要适当延长孵育时间。h.洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。i.加入显色剂TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育15-20分钟。室温偏低时需要适当延长孵育时间，此时可以孵育至标准品出现非常显著的颜色变化，若样品浓度足够高也会出现显著的颜色变化。j.加入终止液50μl/孔，混匀后立即测量A450值。6.结果分析a.复孔的值通常在20%的差异范围内结果才有效，复孔平均值可作为测量值。b.每个标准品或样品的吸光度值应减去本底校正孔的吸光度值(如果没有做校正孔，则不需要减去)。c.绘制标准曲线。以标准品浓度为横坐标，A450值为纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样品的吸光度值和标准曲线计算出样品的相应浓度。
图3. Human CCL11/Eotaxin ELISA Kit的标准曲线。实测数据会因实验条件、检验测试仪器等的不同而存在一定的差异，图中数据仅供参考。d.若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重新测定，计算浓度时需注意乘以样品的稀释倍数。