发布日期： 2024-04-21 16:34:18 来源：GC法检测
药物剂量和组合是影响多效中药疗效的重要的因素。黄连（Coptis chinensis Franch，CF）是一种具有多重功效的代表性中药，常与吴茱萸（Tetradium ruticarpum (A. Jussieu) T. G. Hartley，TR）合用治疗胆汁淤积。本研究评估了CF剂量及其与TR联用对CF治疗胆汁淤积症疗效的影响，包括对粪便代谢和粪便微生物的影响。本研究对α-萘异硫氰酸酯（ANIT，50 毫克/千克）诱导胆汁淤积的大鼠分别给予低剂量（0.3 克/千克）和高剂量（0.6 克/千克）CF，以及分别以0.6克/千克和0.9克/千克的剂量给予CF和TR；通过测定这些处理的抗炎、降脂和抗氧化应激特性，评估了它们的抗胆汁淤积作用；此外，还对粪便代谢组学和粪便微生物进行了分析。结果显示低剂量CF的降血脂作用比高剂量CF更强，而高浓度CF的抗炎和抗氧化应激作用更强。与TR合用可增强CF的降脂作用，但拮抗CF的抗炎作用。对粪便代谢组学和粪便微生物的分析表明，不同剂量的CF以及不同剂量的CF与TR合用时，对脂质和氨基酸代谢相关途径（包括亚油酸、酪氨酸和花生四烯酸代谢途径以及氨基酸生物合成）的调节存在一定的差异。这些差异有几率会使这些制剂的抗胆汁淤积效果不同。CF的剂量会影响其抗胆汁淤积的疗效。与TR合用会对CF的特性产生协同或拮抗作用，这可能是通过改变粪便代谢和粪便微生物平衡来实现的。
各组中观察到的药用植物活性代谢物见图2。低剂量黄连（CF_L）组和高剂量黄连（CF_H）组的主要活性代谢物是小檗碱、黄豆黄素和花生四烯酸，而CT_L组和CT_H组的主要活性代谢物是这三种代谢物以及吴茱萸碱、儿茶酸、异鼠李素、黄柏酮和槲皮素（表3）。
图1 动物实验程序。胆汁淤积模型构建；灌胃法管理；粪便收集；麻醉；收集血液和肝脏组织。
低剂量和高剂量的CF以及它们与TR的组合都具有非常明显的抗胆汁淤积活性、疗效与熊去氧胆酸（UDCA）相似（图3A-G）。病理组织学检查显示，各组植物药都能减轻ANIT引起的炎症和肝细胞坏死（图 3H-O）。综上所述，这些研究根据结果得出，CF 和CT对胆汁淤积症有显著疗效。
CF_L能明显降低胆汁淤积大鼠肝组织中炎症因子IL-1β和IL-6的浓度，显示出一定的抗炎功效、而CF_H则明显降低了IL-1β、TNF-α、IL-6的浓度，增加了IL-10（图 4）。CF有着非常明显的抗炎作用，高CF剂量比低CF剂量更明显，这表明CF剂量与抗炎活性之间有定量关系。然而，添加TR并没有增强低剂量和高剂量CF的抗炎作用。有趣的是，在降低IL-6和增加IL-10浓度方面，CT_H的效果不如CF_L，这表明这两种药物在治疗胆汁淤积症方面的抗炎作用存在拮抗作用。
图3 肝功能检测。血清生化指标：（A）丙氨酸转氨酶（ALT），（B）天冬氨酸转氨酶（AST），（C）碱性磷酸酶（ALP），（D）γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT），（E）直接胆红素（DBIL），（F）总胆红素（TBIL），（G）总胆汁酸（TBA），（H）肝脏炎症和坏死评分，n = 6，***/**/*，p 0.001/p 0.01/p 0.05，ns，无显著性意义。(I-O)组织病理学检查，100x和200x。
通过测量血清和肝脏样本中的脂质水平，确定给药处理对脂质代谢的影响；使用自动生化分析仪检测各组大鼠血清中的脂质相关指数（图 5A-D）。肝组织的油红 O 染色评估了脂肪变性（图 5E）。根据结果得出，CF 或 CT 均能显著减少胆汁淤积大鼠肝组织中脂滴的积聚，改善脂质代谢紊乱。CT_L的降脂效果明显优于CF_L、这表明CF和TR在治疗胆汁淤积症方面具有协同降脂作用。
通过测量这些大鼠血清中谷胱甘肽（GSH）、活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）的浓度，我们确定了治疗的抗氧化应激效果（图6）。CF_L没有显示出明显的抗氧化应激作用，而CF_H则有很明显的抗氧化作用，这原因是只有高剂量的CF才具有抗氧化应激的功效。然而，添加TR并没有显著地增强CF的抗氧化作用。
我们通过无监督主成分分析（PCA）初步确定了样品的总体分布和整个分析过程的稳定性（图 7B-F）；随后，采用有监督的正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）来区分各组间代谢谱的总体差异，并确定这些组中差异表达的代谢物（图7G-J）。为防止模型过拟合，我们对模型的质量进行了7次交互验证和200次响应置换检验（图7K-N）、模型参数见图7A。以上分析显示，CF_H与CF_L、CT_L与CF_L、CT_H与CF_H组之间有显著的代谢差异。
通过单维和多维分析，我们筛选出各组间差异表达的代谢物。在OPLS-DA分析中，我们使用变量投影重要性（VIP）来衡量代谢物表达模式对各组样本分类判别的影响强度，并筛选代谢物的显著差异。组间差异代谢物水平的显著差异通过t检验进行验证。筛选标准为VIP 1，P 0.05，火山图（图 8A-D）显示了组间比较中差异代谢物的表达趋势和数量。模型组和对照组的比较显示，前者有617种代谢物下调，479种代谢物上调。对CF_H组和CF_L组的比较发现，前者有222种代谢物下调，后者有184种代谢物上调。此外，比较CT_L组和CF_L组发现，前者有255种代谢物下调，后者有307种代谢物上调、而CT_H组和CF_H组的比较则发现前者有269种代谢物下调，后者有288种代谢物上调。组间比较的聚类统计分析筛选出了前50种差异表达的代谢物（图8E-H）。不同剂量的CF以及与TR联合使用对胆汁淤积症的治疗效果不同，可能与这些代谢物的不同表达有关。
出现差异表达的代谢物可能是由于不同剂量的CF及其与TR的组合具有不同的抗胆汁淤积功效。对这些差异表达的代谢物进行通路富集分析，可能会揭示这些抗胆汁淤积代谢通路差异的机制。KEGG富集分析在模型组和对照组（图 8I）以及CF_H组和CF_L组的比较中发现了重叠的通路。这些途径包括涉及 ABC 转运体、类固醇生物合成以及亚油酸、花生四烯酸和酪氨酸代谢的途径（图 8J）。这些途径可能是高剂量和低剂量CF在抗炎、降血脂和抗氧化应激效应方面存在差异的原因。研究发现，CT_L和CF_L治疗胆汁淤积疗效的差异与不饱和脂肪酸的生物合成、ABC 转运体和CAMP信号通路的差异有关。CT_H和CF_H的疗效差异与亚油酸代谢的调节有关（图8K、L）。
图8 差异代谢物筛选和功能富集分析。(A-D）大鼠粪便代谢物的火山图、(E-H）大鼠粪便代谢物聚类热图、(I-L）差异代谢物KEGG富集分析。
根据扩增子序列变异（ASV）聚类分析的结果，我们分析了大鼠组有和特有的ASV数量，并绘制成花瓣图（图9A）。对照组、模型组、CF_L组、CF_H组、CT_L组和CT_H组共有三个ASVs。图9B总结了每个样本在不同分类水平上的相对丰度，包括门、纲、目、科、属和种。
样本测序量的合理性通过alpha多样性分析进行评估，该评估包括取样量是否充足以及每个样本中物种的丰度和均匀性（图9C-E）。通过beta多样性分析，包括PCoA和NMDS分析，我们对组间多样性差异进行评估（图 9F-N）。粪便微生物群落在CF_H组和CF_L组、CT_L组和CF_L组以及CT_H组和CF_H组之间存在非常明显差异。这些对肠道微生物群落组成及其功能的影响也可能是不同剂量CF治疗胆汁淤积症以及与TR联合用药后疗效不同的原因。
图9 粪便微生物多样性分析。(A)基于扩增片段序列变异（ASVs）的花瓣图。(B)样本中微生物群落分布统计。(C) Specaccum物种积累曲线。(D) ASV多样性指数稀释曲线。(E)秩丰度曲线。(F-J) PCoA分析。(K-N) NMDS分析。
通过LEfSe和PICRUSt2分析，我们进一步明确了存在一定的差异的微生物种类及其功能。图10A显示了通过LEfSe分析确定的在门、纲、目、科和属水平上丰度相对较高的重要物种。图10B-J显示了在组间比较中属一级差异最大的10个物种。通过比较从模型组和对照组获得的微生物组发现，拟普雷沃氏菌和普雷沃氏菌在CF_H 组和CF_L组中有差异表达，普雷沃氏菌和UCG-005在CT_L组和CF_L组中有差异表达，乳杆菌和普雷沃氏菌在CT_H组和CT_L组中有差异表达。基于16S的KEGG功能预测显示，在治疗胆汁淤积症方面，CF_H与CF_L的差异可能与氨基酸的生物合成有关，CT_L与CF_L的差异可能与2-oxocarboxylic acid代谢有关，CT_H与CF_H的差异可能与氨基酸的生物合成有关。
图10 微生物多元变量的统计分析。(A）LEFSe分析，差异物种注释分支。(B) LDA值分布直方图。(C、D、G、H）属水平丰度差异最大的10个物种。(E、F、I、J）基于16S rRNA基因序列的KEGG功能预测。
根据粪便代谢组学和微生物多样性分析，我们对差异表达的代谢物和微生物进行spearman相关性分析，从而评估粪便代谢物与粪便微生物群属之间的关系（图 11）。结果发现，粪便代谢物与粪便微生物群密切相关。不同剂量的CF和不同剂量的CF搭配TR对胆汁淤积症的治疗效果不同，可能是由于粪便代谢物和粪便微生物群的调节作用不同。
大多数中药具有多重功效。在具体应用中，如何通过调整剂量、选择组合来控制中药的作用方向，是中药方剂学的经典难题。CF及其常用复方药物CT被广泛用于治疗胆汁淤积。ALT和AST直接反映肝细胞的损伤程度，ALP和γ-GT是胆汁淤积的特异性重要标志物；TBIL、DBIL 和 TBA 是胆汁标志物的重要指标。肝组织损伤和炎症程度可通过病理组织学观察直观评估。在本研究中，血清生化指标和肝脏组织病理学观察显示，CF和CT对胆汁淤积症均有显著的治疗效果。在此基础上，我们分别从抗炎作用、降脂作用和抗氧化应激作用三个角度，研究了不同剂量（CF_L、CF_H）和与TR联用（CT_L、CT_H）的CF对胆汁淤积症的治疗作用特点。肝组织中IL-6、TNF-α、IL-10和IL-1β的水映了胆汁淤积引起肝脏炎症的程度，血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C的水映了脂质代谢的情况，而油红O染色则显示了肝组织中脂质堆积的情况。ROS、GSH、SOD、MDA和NO反映了活性氧积累引起的细胞毒性和肝损伤。在剂量上，CF 的抗炎、降血脂和抗氧化应激作用表现出明显的量效依赖性，其中抗炎和抗氧化应激作用随剂量的增加而增强；相反，降血脂作用则随着剂量的增加而减弱。有趣的是，在联合TR上服用CF后，二者在降血脂方面具有协同作用，而在抗炎方面则具有潜在的拮抗作用。
肠道微生物在定植和繁殖过程中会产生一系列代谢物，直接或间接影响宿主的代谢和免疫反应。代谢组学技术是研究中药治疗疾病作用机制的重要研究方法。为分析上述疗效差异的原因，本研究首先利用粪便代谢组测序技术，对模型与对照组、CF_H与CF_L、CT_L与CF_L、CT_H与CF_H进行了显著差异代谢物的筛选，并分别对这些代谢物进行了功能富集分析。亚油酸具有促进新陈代谢、调节内分泌系统和促进脂质代谢等功能。它还是胆固醇代谢的催化剂，可降低血液中胆固醇和脂质的含量。以往的研究表明，亚油酸代谢与炎症和氧化应激密切相关。当肝脏损伤时，亚油酸会从磷脂中释放出来，并进一步产生炎症介质，亚油酸的表达是肝脏损伤的标志。花生四烯酸在过敏、炎症和其他器官功能反应中起着至关重要的作用，花生四烯酸代谢可在一定程度上反映炎症的严重程度。酪氨酸是内源性过氧化物酶的重要底物。酪氨酸及其衍生物在体内和体外的存在可通过ferryl血红素还原作用改善氧化损伤。此外，高水平的酪氨酸可促进脂肪酸合成，进一步促进肝脏脂肪沉积。
之前的多项研究表明，肠道微生物群的生态紊乱与胆汁淤积症的发生密切相关，我们的初步研究之后发现，CF和TR的等量配伍可通过扰乱肠道微生物平衡和代谢平衡对胆汁淤积症产生积极的干预作用。在这项研究中，我们通过对模型 vs 对照组、CF_H vs CF_L、CT_L vs CF_L 和 CT_H vs CF_H的组间比较进行LEfSe分析，分别获得了不同的微生物群落。据报道，普雷沃氏菌是一种共生细菌，其相对丰度与炎症有关，诱导炎症介质（如 IL-6 和 TNF-α）的能力增强。UCG-005有助于促进短链脂肪酸(SCFA)的产生，这有助于缓解炎症和脂质代谢紊乱。乳酸菌通过提高胆盐水解酶的活性和非结合胆汁酸的数量，增加粪便脂质排泄，从而减少肝脏脂质积聚。对差异微生物KEGG功能的预测显示，低剂量和高剂量CF治疗胆汁淤积症的差异与氨基酸生物合成有关、而CF和CT对胆汁淤积症治疗效果的差异与2-oxocarboxylic acid代谢和氨基酸生物合成有关，这与粪便代谢组学分析的结果相似。此外，微生物与代谢物的相关性分析表明，微生物的相对丰度与代谢物的水平之间有关系。
CF的抗炎、降脂和抗胆汁淤积作用已被许多文献报道，我们之前的研究证实，CF和TR联合治疗胆汁淤积症与调节脂质代谢相关基因的表达有关。其他学者的研究也证实了 CF 和 TR 联合使用对脂质代谢紊乱的调节作用。氨基酸代谢与氧化应激紧密关联，如色氨酸是褪黑素合成的必要底物，而褪黑素对治疗胆汁淤积症有显著的抗氧化作用。在今后的研究中，我们将继续探讨不同剂量和组合的TR通过调节脂质和氨基酸代谢改变CF抗胆汁淤积的具体机制。
一般来说，在治疗胆汁淤积症时，小剂量CF的疗效偏向于降脂，而大剂量 CF则偏向于抗炎；此外，CF和TR在降血脂方面具有协同作用，而在抗炎方面可能具有拮抗作用。在生物学机制方面，这可能是由于对肠道微生物学和代谢平衡的双重影响不同所致，其中脂质代谢和氨基酸代谢是关键事件。本研究阐明了CF治疗胆汁淤积症的机制，为CF在胆汁淤积症治疗中的临床应用提供了新思路。
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