发布日期： 2024-04-22 17:34:10 来源：GC法检测
几个世纪以来，鳢肠一直被用于传统医学，并以其保护肝脏的特性而闻名。蟛蜞菊内酯（WEL）和去甲基蟛蜞菊内酯（DWEL）是在鳢肠中发现的主要香豆素类化合物。然而，这两种化合物对非酒精性脂肪肝（NAFLD）的作用仍有待探索。本研究利用硫代乙酰胺（TAA）诱导的斑马鱼肝损伤模型，通过空间代谢组学和肝脏特异性转录组学的综合分析，试图研究WEL和DWEL对非酒精性脂肪肝的影响和机制。我们的研究根据结果得出，WEL和DWEL能显著改善肝功能，减少脂肪在肝脏中的积累。我们还成功绘制了这两种化合物在全身斑马鱼体内的生物分布和代谢图，并确定了WEL和DWEL对内源性代谢物的反向调节作用。基于空间代谢组学和转录组学，我们得知类固醇生物合成和脂肪酸代谢主要参与了WEL而非DWEL的保肝作用。我们的研究揭示了WEL和DWEL在改善非酒精性脂肪肝方面的不同机制，并提出了一个空间代谢组学和肝脏特异性转录组学的“多组学”平台，以开发进一步改善治疗效果的高效化合物。
1.蟛蜞菊内酯和去甲基蟛蜞菊内酯改善了TAA诱导的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。
2.空间代谢组学绘制了斑马鱼全身中蟛蜞菊内酯和去甲基蟛蜞菊内酯的生物分布和代谢。
3.我们对蟛蜞菊内酯和去甲基蟛蜞菊内酯对NAFLD的代谢调节进行了成像。
4.肝脏特异性转录组分析揭示了蟛蜞菊内酯和去甲基蟛蜞菊内酯之间不同的基因表达模式。
5.蟛蜞菊内酯通过调节相关基因（如ebp和dgat2）抑制类固醇生物合成和脂肪酸延伸。
译名：综合空间代谢组学和转录组学破译蟛蜞菊内酯和去甲基蟛蜞菊内酯对非酒精性脂肪肝的保肝机制
本研究的设计如图方案1所示。为了评估WEL和DWEL的潜在肝保护作用，我们将斑马鱼幼鱼暴露于TAA以诱导肝损伤，并同时用WEL或DWEL处理。如图1A所示，与未治疗的对照组相比，TAA组的肝脏大小和荧光强度均显着减小。有必要注意一下的是，当使用WEL或DWEL治疗时，斑马鱼的肝脏面积和累积光密度（IOD）明显地增加（图1B和C），表明WEL和DWEL都能改善肝损伤。同时，经WEL或DWEL处理的斑马鱼没有在肉眼下观察到病理变化。
图1 蟛蜞菊内酯（WEL）和去甲基蟛蜞菊内酯（DWEL）对硫代乙酰胺（TAA）损伤斑马鱼幼鱼的影响。（A）WEL和DWEL的结构及其对TAA损伤斑马鱼幼鱼的肝保护作用。（B）各组肝脏面积的定量分析。（C）肝脏荧光强度的定量分析。数据以均值±标准差表示（n=10）。∗P0.05，∗∗P0.01，∗∗∗P0.001，ns：无显著性。NAFLD：非酒精性脂肪肝；IOD：累积光密度。
方案1 空间代谢组学和转录组学整合策略破译蟛蜞菊内酯（WEL）和去甲基蟛蜞菊内酯（DWEL）对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的保肝机制。TAA：硫代乙酰胺；MALDI-MSI：基质辅助激光解吸/电离质谱成像；Q-TOF：四极杆飞行时间；PCA：主成分分析；GSEA：基因集富集分析；MOD：模型；FA：脂肪酸。
众所周知，TAA会使肝脏的脂质代谢失调，诱导脂质积累，因此导致肝细胞功能的损害。为了验证WEL和DWEL对脂质积累的影响，我们对斑马鱼幼鱼进行了油红O染色。显然，TAA处理组斑马鱼肝脏的脂质水平高于对照组（图2），这在某种程度上预示着TAA在斑马鱼中引起非酒精性脂肪肝。而我们得知脂质在WEL或DWEL处理的斑马鱼肝脏中以剂量依赖性的方式慢慢地减少，这表明WEL或DWEL处理减少了脂质在斑马鱼肝脏中的积累（图2A和B）。斑马鱼的卵黄囊中70%是中性脂质，主要在肝脏代谢，被认为是肝功能的重要体现。图2C的结果为TAA处理的斑马鱼中卵黄囊的面积增加，表明其肝出现吸收功能降低和肝损伤。有必要注意一下的是，WEL和DWEL均能促进卵黄的吸收并导致斑马鱼卵黄囊的面积减少，这与油红O染色的结果一致。我们还发现，WEL和DWEL均降低了因TAA刺激而升高的天冬氨酸转氨酶（AST）和总甘油三酯（TG）的水平（图S1）。综上所述，WEL和DWEL治疗减轻了斑马鱼肝脏中的脂质积累。
图2 蟛蜞菊内酯（WEL）和去甲基蟛蜞菊内酯（DWEL）对斑马鱼肝脏脂质积累的影响。（A）斑马鱼幼鱼的油红O染色。（B）各组斑马鱼肝脏染色的定量分析。（C）斑马鱼幼鱼卵黄囊面积的定量分析。数据以平均值±标准差（n=10）表示。∗P0.05，∗∗P0.01，∗∗∗P0.001，ns：无显著性。白色虚线勾勒出肝脏区域。
质谱成像能够同时表征生物组织中药物及其代谢物的空间分布和相对含量。更好地了解药物的生物分布和代谢必将推进对其安全性和有效性的研究。在本研究中，我们成功地在斑马鱼全身切片上绘制了斑马鱼不同器官中WEL和DWEL的空间分布。此外，我们还对斑马鱼全身切片中WEL和DWEL的I期和II期代谢物进行仔细的检测和成像。
图3A说明了我们在斑马鱼中鉴定的WEL代谢物。在WEL组中，我们得知WEL经过去甲基化生成DWEL，我们还检测到了WEL的甲基化代谢物。此外，我们得知WEL以及DWEL和甲基化WEL在斑马鱼中能够继续进行硫酸化和葡萄糖醛酸化II期代谢反应（图3A）。这一发现与之前报道的大鼠中WEL的代谢过程一致。更有必要注意一下的是，我们在体内鉴定出了WEL、DWEL和甲基化WEL的硫酸化-葡萄糖苷化代谢物，据我们所知，这些代谢物以前没有报道过。我们在斑马鱼中总共鉴定出14种WEL代谢物。图3B显示了WEL及其14种代谢物在斑马鱼不同器官中的MS图像。根据结果得出，WEL及其I期和II期代谢产物主要分布在肝脏和肠道中，而在大脑、肌肉和眼睛等其他器官中的含量非常低。这表明肝脏和肠道是斑马鱼体内WEL的主要代谢器官，也可能是WEL发挥其生物学作用的主要靶器官。
在DWEL组中（图3C），我们得知DWEL可以首先在斑马鱼中发生甲基化以产生甲基化的DWEL。之后，DWEL和甲基化DWEL能更加进一步与硫酸和葡萄糖醛酸结合，质量偏移分别为80Da和176Da。此外，我们得知一分子DWEL和甲基化DWEL可以与一分子硫酸和一分子葡糖苷酸结合，以256Da的质量偏移进行硫酸化和葡萄糖醛酸化反应。并且，一分子DWEL和甲基化DWEL可以与一分子硫酸和一分子葡萄糖结合，以242Da的质量偏移进行硫酸化和糖苷化反应。该分析代表了体内DWEL代谢的首次表征。与WEL一样，DWEL的母体化合物和代谢物主要在肝脏和肠道内表征，而DWEL的葡萄糖苷化或葡萄糖醛酸化代谢产物也在整个身体的其他器官中被检测到（图3D）。表S2显示了WEL和DWEL代谢物的HPLC-HR-MS数据，所有代谢物均使用精确的分子量和小于5ppm的质量精度做验证。我们进一步对这些目标化合物进行了HPLC-HR-MS/MS分析，并利用目标分析物的结构特异性模式离子进行进一步鉴定（图S2−11）。总之，我们的研究强调了WEL和DWEL在斑马鱼中的代谢，这在某种程度上预示着斑马鱼拥有与人类相似的完整代谢器官系统和代谢酶系统，为药物代谢研究提供了理想的模型。
图3 斑马鱼中蟛蜞菊内酯（WEL）和去甲基蟛蜞菊内酯（DWEL）的代谢和空间特征。（A）WEL的代谢途径及其代谢产物的结构推断。（B）质谱（MS）图像描绘了斑马鱼全身切片中WEL及其代谢物的空间分布。（C）DWEL的代谢途径及其代谢产物的结构推断。（D）质谱（MS）图像描绘了斑马鱼DWEL及其代谢物空间分布的MS图像。WEL-Sulf：硫酸化蟛蜞菊内酯；WEL-GlcA：葡萄糖醛酸化蟛蜞菊内酯；WEL-Sulf-GlcA：硫酸化-葡萄糖醛酸化蟛蜞菊内酯；WEL-Sulf-Glc：硫酸化葡萄糖苷化蟛蜞菊内酯；DWEL-Sulf：硫酸化去甲基蟛蜞内酯；DWEL-GlcA:葡萄糖醛酸化去甲基蟛蜞内酯；DWEL-Sulf-GlcA：硫酸化-葡萄糖醛酸化去甲基蟛蜞内酯；DWEL-Sulf-Glc：硫酸化-葡萄糖苷化去甲基蟛蜞内酯；MWEL：甲基化蟛蜞菊内酯；MWEL-Sulf：甲基化和硫酸化的蟛蜞菊内酯；MWEL-GlcA：甲基化和葡萄糖醛酸化的蟛蜞菊内酯；MWEL-Sulf-GlcA：甲基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化的蟛蜞菊内酯；MWEL-Sulf-Glc：甲基化、硫酸化和葡萄糖苷化的蟛蜞菊内酯。
我们进一步对斑马鱼全身切片进行了空间代谢组学研究，以探讨NAFLD发展过程中的代谢变化以及WEL和DWEL对NAFLD的代谢调节。在斑马鱼的大小和H&E染色结果方面，我们在对照组、NAFLD模型组、WEL组和DWEL组之间未曾发现显著差异（图4A）。然后，我们基于区域特异性代谢物指纹图谱进行数据驱动的全身分割分析（图4B）。在全身分割图中，具有相似代谢特征的不一样的区域被分组在一起并被赋予特定的颜色。根据结果得出，所有斑马鱼的全身切片均呈现出显著的颜色多样性，肝脏和肠道区域被指定为热红色，其他器官更多地被指定为冷蓝色。更有趣的是，我们得知与对照组、WEL组和DWEL组相比，NAFLD模型组斑马鱼的肝脏区域呈现出更强烈的红色（图4B）。该根据结果得出，在NAFLD的发展过程中，斑马鱼的肝组织中发生了显著的代谢重编程，并且在给予WEL和DWEL后其代谢特征逐渐恢复正常。
鉴于斑马鱼幼鱼体型的局限性，传统研究对整个斑马鱼幼鱼进行NAFLD相关代谢改变的分析，这导致没办法准确获得器官特异性代谢特征。我们将MSI引入代谢组学，提供了一种精确表征NAFLD相关代谢改变的洞察方法。如图4C和D所示，当我们提取斑马鱼全身切片的代谢特征进行主成分分析（PCA）和概率潜在语义分析（PLSA）时，对照组、NAFLD模型、WEL组和DWEL组的代谢特征难以被识别和区分。然而，如果提取斑马鱼全身切片肝脏区域的肝脏特异性代谢谱进行PLSA分析，我们得知对照组、NAFLD模型、WEL组和DWEL组有明显的聚类和分组趋势（图4E）。总体而言，与对照组相比，NAFLD组的肝脏代谢发生了显著改变，而WEL组和DWEL组的代谢特征更接近对照组（图4E中的箭头），这表明WEL和DWEL能够部分抑制NAFLD引起的代谢改变。这也与我们之前的发现相呼应，即WEL和DWEL可以预防或改善肝损伤。
我们继续对NAFLD上WEL和DWEL调节的区别性代谢物进行筛选和成像。作为全身氮代谢和能量代谢的主要参与者，谷氨酰胺在NAFLD中表现出代谢稳态被破坏，其表达显著增加。然而，给予WEL和DWEL后，这样的一种情况得到了显著缓解（图4F）。在谷氨酰胺酶的催化下，谷氨酰胺可以代谢成谷氨酸，谷氨酸随后进入TCA循环产生能量或用于谷胱甘肽的合成。我们得知谷氨酸和谷胱甘肽的水平也有类似的趋势（图4G和H）。肝糖原代谢与全身脂质代谢错综复杂地交织在一起，脂肪肝也可导致肝脏糖异生的增加。在这里，NAFLD中葡萄糖和磷酸葡萄糖（GPP）的水平升高，而WEL和DWEL干预则下调了其水平（图4I和J）。在NAFLD中，苹果酸和琥珀酸（TCA循环的参与者）的水平也升高，表明肝脏迫切地需要能量供应，而在WEL和DWEL的影响下，肝脏这种对于能量的需求被逆转（图4K和L）。此外，空间代谢组学显示NAFLD中胆固醇、磷脂和脂肪酸的水平增加，如硫酸胆固醇（CSS）、磷脂酰乙醇胺（PE）-34：0、磷脂酰丝氨酸（PS）-36：2、溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）-18：0、脂肪酸（FA）-16：0、FA-16：1、FA-18：0、FA-20：4、FA-22：5和FA-22：6。WEL和DWEL的施用则可以逆转这些脂质水平的紊乱（图4M−W）。然而，还必须要格外注意的是，并非所有脂质都受到WEL和DWEL的调节，例如磷脂酰甘油（PG）-36：4、PG-36：5和PG-38：4（图S12）。综上所述，我们得知WEL和DWEL可以显著缓解NAFLD引起的代谢改变。
图4 空间代谢组学筛选出蟛蜞菊内酯（WEL）和去甲基蟛蜞菊内酯（DWEL）对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）调节的有区别的代谢物。（A）模型、WEL或DWEL和对照组的苏木精和伊红（H&E）染色图像。（B）基于基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）数据的代谢物驱动的全身分割分析。（C）全身主成分分析（PCA）。（D）全身概率潜在语义分析（PLSA）。（E）肝脏特异性PLSA分析。（F−W）斑马鱼全身切片和肝脏区域中有改变代谢物的MALDI-MS图像和表达水平。**P0.001。CT：对照;GPP：磷酸葡萄糖;CSS：硫酸胆固醇;lysoPE：溶血磷脂酰乙醇胺;PE：磷脂酰乙醇胺;C26：0-OH-SFT：C26：0-OH-硫酸脑苷脂;PS：磷脂酰丝氨酸;LysoPC：溶血磷脂酰胆碱;FAs：脂肪酸。
5. 肝脏特异性转录组分析揭示了WEL和DWEL治疗NAFLD的差异基因表达模式和潜在功能途径
为了深入研究WEL和DWEL对NAFLD治疗效果背后的复杂分子途径，我们对对照组、NAFLD模型组以及WEL治疗组和DWEL治疗组的斑马鱼肝脏进行了RNA测序。我们利用具有肝脏特异性荧光蛋白表达和可视化特性的转基因斑马鱼，在荧光显微镜下准确分离斑马鱼肝脏，确保肝脏样本采集的准确性和转录组学分析的针对性。与对照组相比，我们在TAA诱导的NAFLD组共鉴定出5587个差异表达基因（DEGs），其中2664个上调，2923个下调。与NAFLD组相比，WEL处理组表现出1408个DEGs（619个上调和789个下调），而DWEL组则表现出529个DEGs（321个上调和208个下调，图5A−C）。FPKM值的堆叠直方图呈现出组内基因表达模式的高度一致性（图5D）。值得一提的是，我们在三个实验比较中发现有71个DEGs重叠，这代表了WEL和DWEL处理对TAA诱导的NAFLD的共同调节途径。聚类热图进一步说明了这71个基因的mRNA图谱将WEL和DWEL处理组与NAFLD组清楚地分离出来（图5E）。通过对KEGG富集分析，我们得知包括细胞信号传导、能量代谢、细胞凋亡和细胞外基质相互作用在内的几种生物过程被深度富集，表明这些途径是WEL和DWEL调节NAFLD的共同机制（图S13）。
当对WEL与NAFLD组和DWEL与NAFLD组的DEGs进行通路富集分析时，我们观察到其中存在很明显的差异（图5F）。与NAFLD组相比，WEL治疗组的DEGs主要富集于与类固醇生物合成、细胞凋亡、辅助因子生物合成、叶酸生物合成和DNA复制相关的通路，这些通路与维持正常肝功能和减少脂肪沉积紧密关联。相比之下，DWEL治疗组和NAFLD组的DEGs主要富集于ECM-受体相互作用、MAPK信号通路、产生IgA的肠道免疫网络、叶酸一碳库和范可尼贫血通路等，这些通路参与信号转导调控和免疫调节等生物学过程，表明WEL和DWEL通过不同的机制对NAFLD发挥作用。
图5 蟛蜞菊内酯（WEL）和去甲基蟛蜞菊内酯（DWEL）广泛改变了斑马鱼肝脏的基因表达模式。（A）在三个比较中总差异表达基因（DEGs）的维恩图分析：非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）组与对照组、WEL治疗组与NAFLD组和DWEL治疗组与NAFLD组。（B, C）上调和下调的DEGs统计量由彩色柱（B）和火山图（C）表示。（D）每个样品中基因的FPKM（每百万个映射读数中转录本的每千碱基片段）值的堆叠直方图。（E）71个DEGs的热图在三个比较中重叠。（F）WEL和DWEL治疗组与NAFLD组DEGs的KEGG通路富集分析。KEGG：京都基因和基因组百科全书。
6. 转录组学和代谢组学的综合分析系统地揭示了WEL和DWEL在肝脏代谢调控方面的差异
为了更深入地了解WEL和DWEL治疗引起的代谢途径的变化，我们对转录组学和代谢组学进行了综合分析。单样本基因集富集分析（ssGSEA）显示NAFLD在基因水平上有显著的代谢功能障碍。有趣的是，WEL治疗可以有效逆转其中大部分的代谢途径。然而，DWEL的作用相对有限，表明这些途径与WEL而不是DWEL对NAFLD的调节作用之间有直接相关性（图6A）。然后我们通过基因集富集分析（GSEA）测试类固醇生物合成和脂肪酸延伸的代谢途径，发现WEL处理下调了这些途径（图6B）。类固醇生物合成和脂肪酸延伸是与NAFLD高度相关的生物学过程，因为它们的失调会导致胆固醇和脂肪酸的积累，而胆固醇和脂肪酸是NAFLD进展中脂毒性的重要的条件。这些结果有力地表明，WEL通过调节胆固醇和脂肪酸代谢对NAFLD发挥了治疗作用，这与代谢组学分析的结果一致。
我们通过qRT-PCR进一步验证了几个相关基因的表达，以加强WEL对NAFLD的潜在机制的证据（图6C和D）。Emopamil结合蛋白（Emopamil-Binding Protein， Ebp）是胆固醇生物合成中的重要酶，可催化Delta（8）-甾醇转化为Delta（7）-异构体，对于类固醇的稳态至关重要。它的表达在TAA诱导的NAFLD中显著上调，并在WEL处理中被逆转下调。我们还验证了WEL在脂肪酸代谢途径中对dgat2基因显著下调。Dgat2负责编码二酰基甘油O-酰基转移酶，该酶利用二酰基甘油和脂肪酰辅酶A作为底物催化甘油三酯的形成。下游基因pnpla3参与甘油三酯中酰基链的重塑，而其被证明在WEL处理后上调。此外，我们验证了WEL可以反向调节chac1的表达，导致谷胱甘肽的降解，这与代谢组学数据一致（图6D和4H）。总之，我们已证明WEL和DWEL通过不同的机制改善NAFLD。抑制类固醇生物合成和调节脂肪酸代谢是与WEL（而非DWEL）作用特别相关的重要途径。
图6 蟛蜞菊内酯（WEL）和去甲基蟛蜞菊内酯（DWEL）处理后的转录组学和代谢组学谱的综合分析。（A）每个样本中关键代谢途径的单样本基因集富集分析（ssGSEA）。（B）WEL和DWEL治疗组与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）组类固醇生物合成和脂肪酸延伸的基因集富集分析（GSEA）。（C）类固醇合成、脂肪酸代谢和谷胱甘肽代谢的生物学过程以及所涉及的关键基因。（D）通过定量实时荧光定量PCR（qRT-PCR）确定的基本代谢途径中基因的相对mRNA水平。数据以平均值±标准差（n=10）表示。∗P0.05，∗∗∗P0.001。NES：标准化富集评分;FDR：错误发现率;TAA：硫代乙酰胺;farnesyl-PP：法呢基焦磷酸盐。
本研究为WEL和DWEL对NAFLD的治疗作用提供了证据，并提出了一种将基于MSI的空间代谢组学与肝脏特异性转录组学相结合的新方法，以探索其潜在机制。通过空间代谢组学，我们全面绘制了斑马鱼体内WEL和DWEL的代谢途径以及有区别的内源代谢产物。此外，我们通过转录组学分析揭示了WEL和DWEL对NAFLD的不同机制，并揭示了WEL的保肝作用主要与类固醇生物合成和脂肪酸代谢的调节有关。我们的研究结果不仅提供了对WEL和DWEL对NAFLD影响的整体理解，而且还强调了综合空间代谢组学和肝脏特异性转录组学在阐明有效干预的复杂机制方面的重要性。
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