发布日期： 2024-03-26 03:10:20 来源：新产品展示
短串联重复序列(shorttandemrepeat，str)也称微卫星dna(microsatellitedna)或简单重复序列(simplesequencerepeat，ssr)，是广泛存在于人类基因组的一类以几个碱基为核心单位串联重复形成的dna序列。str基因座分布广泛，人基因组中平均每100～200kb中出现一个，其核心重复单位一般为2～6个碱基，重复次数在10～60次之间。由于不同个体间的重复单位次数的差异而具备极高的多态性，同时这种多态性在遗传过程中遵照孟德尔遗传规律，因此str遗传分析被大范围的应用于法医个体识别、亲缘鉴定、群体遗传学等诸多领域。
复合扩增技术(多重pcr)是目前检测str最主要的技术方法，这是由于str基因座片段小、易扩增且各基因座之间的扩增条件接近，因此能够将两个及两个以上基因座放在同一反应管中进行复合扩增，其优点是高效率和高产率，有效节约时间和所需试剂。通过将不同荧光分子标记于各基因座引物末端即可利用毛细管电泳技术将扩增出的多种不同片段分离开，并通过与dna分子量标准对比精确计算出str等位基因片段大小，进而实现str分型。
目前，str遗传分析技术已成为法庭科学鉴定中最常用、发展最成熟的技术而被用于各类案件检验。str数据也慢慢的变成了各国法庭科学数据库的重要组成部分，以实现对嫌疑犯dna数据的比对和排查。美国fbi选用以下13个核心str基因座用于构建dna分型数据库(combineddnaindexsystem，codis)，包括：d3s1358，d5s818，d7s820，d8s1179，13s317，d16s539，d18s51，d21s11，csf1po，fga，th01，tpox，vwa。90年代中后期，美国abi公司和promega公司分别推出ampfistridentifiler试剂盒与16试剂盒，均包括以上13个str基因座。国内也相似产品，如基点认知技术有限公司推出的goldeneye20a等。目前所采用的试剂盒大多数是以上述codis标准中13个核心基因座为基础，增加另外位点的基因座。
但现有的str遗传分析技术存在引物设计和str分组不合理、一定要通过复杂方法处理dna模板、扩增体系以及反应条件不佳等缺陷，导致扩增效率低、检测时间长和分型效果差。
本发明的第一目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒能快速、准确地对所述16个str位点进行扩增和分型。
本发明的第二目的是提供一种使用上述试剂盒进行pcr的方法，通过所描述的方法能快速、准确地对上述16个str位点进行分型。
本发明还涉及一种使用上述试剂盒进行pcr的方法，所描述的方法包括以下步骤：(1)将上述试剂盒中的试剂与dna模板混合并进行pcr反应；(2)分析扩增产物的丰度。
本发明所述试剂盒涉及16对上、下游引物对，上述16对上、下游引物对具有特异性好、扩增效率高的优点，在pcr扩增过程中不会形成引物二聚体、非特异扩增和交叉反应，避免非目的产物的出现对分型结果的影响，同时扩增效率高，检测信号强，一方面可以缩短pcr扩增时间，另一方面由于检测信号高，可以快速、准确地实现对pcr产物的检测和str分型。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括16对上、下游引物对中的13对、14对、15对或16对。
在一些实施方式中，试剂盒中包括的所述上、下游引物对被不同荧光染料标记为不同的组。
在一些实施方式中，所述上下游引物对被不同荧光染料标记为3组、4组、5组或6组。
在一些实施方式中，每对上、下游引物中至少有一条引物的5’端或3’端被荧光染料标记。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括所述16对上、下游引物对，其中所述16对上、下游引物对分别被4种不同荧光染料标记为4组。
在一些实施方式中，标记第1组引物对的荧光染料为fam，标记第2组引物对的荧光染料为hex，标记第3组引物对的荧光染料为tamra，标记第4组引物对的荧光染料为rox。
本发明所述试剂盒对所述上、下游引物对的对数、分组和荧光标记情况作出限定，其中，通过引物对的巧妙分组确保组内引物对扩增获得的产物在分子量大小上不存在重叠，配合不同荧光染料标记不同组的引物对，只需要对产物进行一次分析即可同时获得多对引物的pcr检测结果，从而实现多位点str分型。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括pcr反应缓冲液、dntps、dna聚合酶、去离子水、上样缓冲液和dna分子量内标中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述上、下游引物对还与所述pcr反应缓冲液、dntps和dna聚合酶中的一种或几种混合在一起。
在一些实施方式中，所述上样缓冲液选自甲酰胺、去离子甲酰胺；优选地，所述上样缓冲液为去离子甲酰胺。
本发明所述试剂盒对上述16对上下游引物的摩尔量进行调整，确保组内引物的扩增效率一致，从而可以简单、快速地对分析检测结果，进行str分型。
本发明还涉及使用上述组合物或上述试剂盒进行pcr的方法，所述方法有以下步骤：所述方法包括以下步骤：(1)将上述试剂盒中的试剂与dna模板混合并进行pcr反应；(2)分析扩增产物的丰度。
本发明所述方法涉及16对上、下游引物对，上述16对上、下游引物对具有特异性好、扩增效率高的优点，在pcr扩增过程中不会形成引物二聚体、非特异扩增和交叉反应，避免非目的产物的出现对分型结果的影响，同时扩增效率高，检测信号强，一方面能够缩短pcr扩增时间，另一方面由于检测信号高，能够迅速、准确地实现对pcr产物的检测和str分型。
在一些实施方式中，所述dna模板通过饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法提取。
在一些实施方式中，所述dna模板为含有dna的血滤纸片、唾液卡片或fta卡。
本发明所述方法能够直接以血滤纸片、唾液卡片、fta卡等为dna模板进行扩增，不需要对dna进行提取，极大缩短获得最终分型结果所需要的时间。
在一些实施方式中，所述pcr反应的退火温度为59～62℃，循环次数为28～32次；优选地，所述pcr反应的退火温度为60.5℃，循环次数为30次。
在一些实施方式中，所述pcr反应的条件为：第1步，92～95℃变性3～8min；第2步，92～95℃变性5～15s；第3步，59～62℃变性0.5～2min；第4步，70～73℃延伸20～40s；第5步，重复第2～4步28～32次；第6步，58～61℃延伸7～12min；第7步，2～6℃持续保温。
在一些实施方式中，所述pcr反应的条件为：第1步，93～95℃变性3～6min；第2步，93～95℃变性7～15s；第3步，60～62℃变性0.5～1.5min；第4步，71～73℃延伸25～35s；第5步，重复第2～4步29～31次；第6步，59～60℃延伸8～11min；第7步，3～5℃持续保温。
在一些实施方式中，所述pcr反应的条件为：第1步，94～95℃变性3～5min；第2步，94～95℃变性7～10s；第3步，60～61℃变性0.5～1min；第4步，71～72℃延伸25～30s；第5步，重复第2～4步29～30次；第6步，59～60℃延伸9～10min；第7步，4～5℃持续保温。
在一些实施方式中，所述pcr反应的条件为：第1步，94℃变性5min；第2步，94℃变性10s；第3步，60.5℃变性1min；第4步，72℃延伸30s；第5步，重复第2～4步30次；第6步，60℃延伸10min；第7步，4℃持续保温。
在一些实施方式中，所述扩增产物的丰度通过以下步骤进行分析：将pcr反应产物和等位基因阶梯分别与上样缓冲液和dna分子量内标混合，经高温变性和冰上冷却后，进行电泳分离。
在一些实施方式中，在92～96℃变性2～5min后，立即放在冰上冷却2～5min。
在一些实施方式中，所述str分型包括利用数据分析软件对样品和等位基因阶梯的电泳结果进行分析和比对，从而得到分型结果。
在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：(1)将序列如seqidno：1-32所示的引物与dna模板混合并进行pcr反应；(2)分析扩增产物的丰度。
1)、本发明所述试剂盒和pcr方法中及的16对上、下游引物对，所述上、下游引物对具有特异性好、扩增效率高的优点，在pcr扩增过程中不会形成引物二聚体、非特异扩增和交叉反应，避免非目的产物的出现对分型结果的影响，同时上述引物还具有扩增效率高，检测信号强的优点，一方面可以缩短pcr扩增时间，另一方面可以快速、准确地实现对pcr产物的检测和str分型。
2)、本发明所述试剂盒和pcr方法通过巧妙的分组，避免同一组str位点的扩增产物在分子量大小上出现重叠，使扩增结果简单明确、一目了然，从而可以快速、准确地根据检测结果进行str分型。
3)、本发明所述试剂盒和pcr方法对16对上下游引物的摩尔浓度比做调整，确保组内引物的扩增效率一致，从而能够简单、快速地分析检测结果，进行str分型。
4)、本发明所述试剂盒和pcr方法不但能够将pcr扩增时间缩短至37～110分钟，还能直接以血滤纸片、唾液卡片、fta卡等为dna模板进行扩增，不需要对dna进行提取，极大缩短获得最终分型结果所需要的时间并降低实验的复杂程度。
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为以利用提取的dna为样本复合扩增16个str位点的毛细管电泳图谱；
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明中使用的术语“试剂盒”既可以包括多试剂，也可以只包括单试剂；所述试剂既可以是组合物也可以是化合物。
利用dna提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)处理血液样品，稀释提取的基因组dna浓度至0.3ng/μl。
将序列如seqidno：1-32所示的引物混合在一起，配制引物混合物，其中，所述引物混合物中各引物的浓度如表1所示。
将含dna聚合酶的pcr反应缓冲液10μl，引物混合物6μl，dna模板2μl，去离子水2μl混合均匀，配制成20μlpcr反应体系。
第1步，94℃变性5分钟；第2步，94℃变性10秒；第3步，60.5℃退火1分钟；第4步，72℃延伸30秒；第5步，重复2-4步30次；第6步，60℃延伸10分钟，4℃持续保温。
将liz500橙色内标及去离子甲酰胺按1:9比例进行混合，配制成上样混合物，取2μl样品或等位基因阶梯，与上样混合液进行混匀，经95℃变性3min，立即放在冰上冷却3min，然后上机进行毛细管电泳分离。
采用genemaker软件分析处理检测结果，见图1，其中通道a为标记fam荧光分子的峰，通道b为标记hex荧光分子的峰，通道c为标记tmera荧光分子的峰，通道d为标记rox荧光分子的峰。
图1所示毛细管电泳图谱无杂峰，只出现目的产物峰且峰值较高，在1000～2000之间，同一通道内目的产物峰的峰值一致。图1所示检测结果表明，首先，在复合扩增体系中，所述16对上下游引物的特异性好，pcr扩增过程不会形成引物二聚体、非特异性扩增或交叉反应，避免非目的产物的出现影响分型结果而出现误判；其次，通过合理的分组和引物设计，避免同一组str位点的扩增产物在分子量大小上重叠，是扩增结果简单明确、一目了然，从而能够迅速、准确地根据检测结果进行str分型；再者，通过调整各引物对的比例，使同一通道内的目的峰峰值基本一致，避免同一通道内目的产物峰的峰值高低差距过大而给分型带来阻碍。
带有血样的血液采集卡，利用打孔器取1.5mm卡片作为模板dna直接进行扩增。
将序列如seqidno：1-32所示的引物混合在一起，配置引物混合物，其中，所述引物混合物中各引物的浓度如表2所示。
配制20μlpcr反应体系，所述反应体系包括含dna聚合酶的pcr反应缓冲液10μl、引物混合物6μl，去离子水2μl和作为模板dna的1.5mm采血卡卡片。
第1步，94℃变性5分钟；第2步，94℃变性10秒；第3步，60.5℃退火1分钟；第4步，72℃延伸30秒；第5步，重复2-4步28次；第6步，60℃延伸10分钟，4℃持续保温。
将liz500橙色内标及去离子甲酰胺按1:9比例进行混合，配制成上样混合物，取2μl样品或等位基因阶梯，与上样混合液进行混匀，经95℃变性3min，立即放在冰上冷却3min，然后上机进行毛细管电泳分离。
采用genemaker软件分析处理检测结果，见图2，其中通道a为标记fam荧光分子的峰，通道b为标记hex荧光分子的峰，通道c为标记tmera荧光分子的峰，通道d为标记rox荧光分子的峰。
图2所示毛细管电泳图谱中无杂峰，只出现目的产物峰且峰值较高，在500～2000之间，表明即使直接以采血卡卡片为dna模板，本发明仍可以特异性、高效率地扩增得到目的产物，从而简单、快速地对str进行分型，缩短整个实验过程所需时间。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案做修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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